ATRAGENE SPECIOSA WEINM. CULTURE IN VITRO:THE CYTOGENETIC ANALYSIS AND FORMATIONOF TRITERPENOID GLYCOSIDES AND FLAVONOIDS.pdf В народной медицине Востока издавна для лечения широкого спектра забо-леваний используется княжик сибирский (Atragene speciosa Weinm.) [1]. Со-временные исследования показали ноотропное, адаптогенное и антиоксидант-ное действие этого растения [2]. Основными группами веществ княжика си-бирского, отвечающими за фармакологическую активность, являются тритер-пеновые _______467гликозиды, флавоноиды и производные фенилэтанола [3, 4]. Как пока-зали исследования препаратов с ноотропным действием, полученных из расте-ний, они по своей активности превосходят такой препарат ноотропного ряда,как пирацетам. При этом практически отсутствуют побочные эффекты, а стои-мость растительных препаратов такого класса намного ниже синтетических.Однако препятствием для разработки лекарственных растительных препа-ратов являются ограниченность или отсутствие запасов сырья, связанные сособенностями биологии вида. Atragene speciosa Weinm. - лиана, и в силутакой специфики затруднена ее интродукция. Остается возможность введе-ния княжика сибирского в культуру клеток in vitro, что позволяет получатьВ.Ю. Дорофеев, 38 Р.А. Карначук, С.В. Пулькина и др.экологически чистое сырье круглогодично, независимо от климатическихусловий. В настоящее время для некоторых видов созданы клеточные куль-туры in vitro, способные к синтезу вторичных соединений, продуцентами ко-торых являются целые растения [5, 6].Объект и методики исследованияОбъектом исследования явилась каллусная культура клеток княжика сибир-ского, полученная __________от разных эксплантов интактных растений, растущих в окре-стностях Степановки (г. Томск). Получение и культивирование каллуса прово-дили на оптимизированных питательных средах Мурасиге-Скуга с добавлениемгормонов 2,4-Д (2,4 дихлорфеноксиуксусная кислота), НУК (α-нафтилуксуснаякислота) и БАП (6-бензиламинопурин) в разной концентрации. Выращиваниепроводили в темноте с продолжительностью субкультивирования 30-40 сут.В культурах каллуса с 5-го по 10-й пассаж и 70-го пассажа анализировалинакопление тритерпеновых гликозидов (сапонины) и флавоноидов спектро-фотометрическим методом. Метод определения количественного содержанияфлавоноидов основан на процессе комплексообразования флавоноидов схлоридом алюминия (III). Использовали 200-300 мг сухой массы клеток кал-луса. Экстракцию проводили трижды 50% этиловым спиртом на водяной ба-не в течение 30 мин. Далее проводили спектрофотометрическое измерениесуммы флавоноидов [7]. Для количественного определения сапонинов ис-пользовали 1 г сухой массы каллусных клеток. Экстрагировали трижды горя-чим ацетоном. Измеряли оптическую плотность водного раствора осажден-ных аммиаком сапонинов на спектрофотометре СФ-46.Каллусная культура 10-го пассажа княжика сибирского in vitro была про-анализирована на цитогенетическую стабильность. Определение митотиче-ской активности каллуса проводили с помощью темпоральной фиксации поодному образцу каллусной культуры с 9 до 18 ч в спирт-уксусной смеси втечение 6 ч. Для цитогенетического анализа 31 образец каллусной культуры10-го пассажа фиксировали в спирт-уксусной смеси (3:1) в течение 6 ч спредварительной обработкой в 0,1% р-ре колхицина в течение 3 ч. Материалхранился в 80% спирте при температуре +4ºС. Окрашивание проводили аце-тогематоксилином по Смирнову [8]. Анализ стадий клеточного цикла и числахромосом проведен на временных давленых препаратах. В исследовании ис-пользованы клетки меристематического типа [9].Результаты и обсуждениеВ лабораторных экспериментах было получено от разных эксплантов не-сколько линий клеточной культуры Atragene speciosa Weinm. При длитель-ном культивировании в клеточной культуре княжика сибирского на твердойсреде образуются физиологически активные вещества, в том числе тритерпе-новые гликозиды и флавоноиды (табл. 1). Их уровень растет, достигая 80%содержания сапонинов по отношению к листьям целого растения. Содержа-ние флавоноидов в клетках 70-го пассажа составило около 40% также в срав-Культура княжика сибирского (Аtragene sрeciosa Weinm.) 39нении с листьями интактного растения. Возможно, изменение уровня сапо-нинов и флавоноидов является результатом генетической изменчивости вкультуре in vitro, в основе которой лежит изменение плоидности [10].В литературе имеются сведения о кариотипе дикорастущего княжика си-бирского [11-13]. В изученных природных популяциях Восточной и Запад-ной Сибири, Тувы и Северо-Востока европейской части СССР, по литератур-ным данным, вид представлен растениями с диплоидным числом хромосом2n = 16. В кариотипе выявлены метацентрические и субметацентрическиехромосомы и одна пара акроцентрических хромосом. Для растений популя-ции в окрестности г. Томска в кариотипе отмечены две пары спутничныххромосом (субакроцентрическая и акроцентрическая пары) [13].Авторами впервые проведены цитогенетические исследования по изучениюгенетической изменчивости клеток каллуса княжика сибирского. Известно, чтопри введении в клеточную культуру растительные клетки теряют генетическуюстабильность и наблюдается формирование высокого уровня полиплоидии и анеу-плоидии [14]. Одним из важных факторов, нарушающих генетическую стабиль-ность в культуре клеток, являются гормоны питательной среды [15]. Значитель-ную роль играет видовая специфика [16]. Некоторые виды сохраняют стабиль-ность морфологии хромосом при длительном культивировании каллуса [17].Для клеток меристематического типа каллусной культуры показана из-менчивость в числе хромосом, которая проявилась в наличии клеток с дипло-идным числом хромосом (2n = 16), полиплоидией, анеуплоидией и структур-ными перестройками хромосом (табл. 2). Клетки округлые с одним крупнымядром, занимающим 1/3 площади клетки. Показано, что максимум митотиче-ской активности приходился на 12-14 ч и составил в среднем около 4%.В клетках 10-го пассажа преобладающими оказались тетраплоидные клет-ки (29,6%), частота клеток с исходным диплоидным числом хромосом и три-плоидией составила 22,9 и 21,9% соответственно. В небольшом процентеклеток отмечаются пента-, гекса-, гепта-, окта- и новемхромосомные числа(от 1,0 до 4,4%). В этой группе наибольший процент составили клетки с гек-саплоидным числом хромосом (табл. 2). Анеуплоидия обнаружена в 10,8%клеток, в основном встречается гипердитриплоидия. Клетки со структурнымиперестройками хромосом отмечены в 3,1%. Наблюдалось преобладание ги-пертетраплоидных клеток с ацентрическими фрагментами, а гипо- и гипер-диплоидия с дицентрическими хромосомами, гипертритетраплоидия с мини-хромосомами встречались очень редко (табл. 2).В результате исследований установлено, что по числу хромосом в клеткеможно выделить несколько типов каллусов:- I тип - полиплоидные и диплоидные клетки (48,4%): 1-й цитотип -4х = 32; 2-й цитотип - 3х = 24; 3-й цитотип - 2n = 16;- II тип - диплоидные, полиплоидные и анеуплоидные клетки (32,3%):1-й цитотип - 4х = 32; А (анеуплоидия); 2-й цитотип - 3х = 24; А; 3-й цитотип -2n = 16; 3х = 24; А; 4-й цитотип - 2n = 16; 4х = 32; А; 5-й цитотип - 2n = 16;- III тип - диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные и анеуплоидные соструктурными перестройками (19,3%).В.Ю. Дорофеев, 40 Р.А. Карначук, С.В. Пулькина и др.Т а б л и ц а 1Содержание биологически активных веществ в каллусной культуреAtragene speciosa Weinm.№ пассажа Биологически активные вещества, % Сапонины Флавоноиды5 0,050 ± 0,002 Следы6 0,060 ± 0,008 Следы7 0,040 ± 0,005 0,040 ± 0,0208 0,026 ± 0,005 0,070 ± 0,0309 0,030 ± 0,004 0,090 ± 0,03010 0,040 ± 0,004 0,070 ± 0,04070 (20 сут) 0,100 ± 0,010 0,100 ± 0,05070 (40 сут) 0,145 ± 0,016 0,178 ± 0,038Примечание. Данные в таблице представлены в виде средней арифметической с ошибкой.Т а б л и ц а 2Числа хромосом и аберрации хромосом в каллусной культурекняжика сибирского 10-го пассажаЧастота клеток с разным числом хромосом, %2n 3х 4х 5х 6х 7х 8х 9х Анеуплоидия и струк-турные аберрацииЧисло образцов кал-лусной культурыЧисло клеток16 24 32 40 48 56 64 72АнеуплоидияАцентриче-ский фрагментДицентрикМини-хромосома31 389 22,9 21,9 29,6 1,3 4,4 3,6 1,5 1,0 10,8 1,5 0,8 0,8В III типе каллусных культур преобладали цитотипы 4x = 32; А; ацентри-ческие фрагменты. Единично отмечались цитотипы 4x = 32; А; ацентриче-ские фрагменты и дицентрические хромосомы, а также цитотипы 4x = 32; А;ацентрические фрагменты, дицентрические и мини-хромосомы.Таким образом, цитогенетический анализ клеток каллусной культуры10-го пассажа княжика сибирского показал, что разные цитогенетическиеаномалии генерируются в новый уровень плоидности и новые числа хромо-сом. Полиплоидия может являться значительным резервом изменчивости,которая реализуется в формировании стабильных каллусов разной плоидно-сти, что является одним из способов промышленного получения клеточнойкультуры и ее вторичных метаболитов.

Скачать электронную версию публикации