Sensitivity of respiration and swelling of cereals mitochondria to modifying permeabilitymitochondrial membranes compounds.pdf В последнее время изменение проницаемости митохондриальных мембранпривлекает большое внимание в связи с тем, что разобщение окислительногофосфорилирования и набухание матрикса митохондрий являются событиями,предшествующими открытию в митохондриях высокопроницаемой поры (отангл. рermeability transition pore), высвобождению цитохрома с и инициациипрограммированной клеточной гибели (ПКГ) [1, 2]. Вовлеченность митохон-Н.120 С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимовадрий в ПКГ как у животных, так и у растений не вызывает сомнений. Веду-щую роль в изменении проницаемости митохондриальных мембран играютионы Са2+ , увеличение содержания которых в матриксе приводит к их взаи-модействию со свободными жирными кислотами (СЖК) и индукции набуха-ния органелл, открытию поры и индукции ПКГ [3, 4]. Способность жирныхкислот вызывать открытие высокопроницаемой поры объясняется как ихпротонофорным действием [5, 6], так и непосредственным взаимодействием сАДФ/АТФ-антипортером [7]. Механизм индукции митохондриальной поры урастений изучен мало. Существование классической поры в растительныхмитохондриях, чувствительной к циклоспорину А (ЦА), до сих пор обсуждает-ся, а данные о влиянии стрессовых факторов на процессы, происходящие приоткрытии высокопроницаемых пор у растений и приводящие к клеточной ги-бели, фрагментарны. В митохондриях растений обнаружены как чувствитель-ные к ЦА высокопроницаемые поры [8, 9], так и нечувствительные [10-12].Установлено, что окислительный стресс, вызванный обработкой Н2О2, яв-ляется причиной выхода цитохрома с в цитозоль в клетках арабидопсиса [9].ПКГ, индуцированная тепловым шоком, в растениях огурца [13] и аноксияозимой пшеницы [12] также приводят к высвобождению цитохрома с из ми-тохондрий этих растений. Показано, что холодовой стресс служит стимуломдля активации ПКГ в культуре клеток табака BY-2, который приводит к спе-цифической фрагментации хроматина, сопряженной с апоптическими изме-нениями ядра и цитоплазмы [14]. В то же время отсутствуют данные о влия-нии холодового воздействия на изменение проницаемости мембран митохон-дрий растений. Этиолированные проростки злаков представляют удобнуюмодель для изучения изменения проницаемости митохондриальных мембран,поскольку колеоптиль и первый лист злаков в процессе онтогенеза претерпе-вает ПКГ [15].Целью настоящей работы явилось изучение влияния соединений, изме-няющих проницаемость митохондриальных мембран, на функционированиемитохондрий злаков, различающихся по степени холодоустойчивости.Материалы и методы исследованияВ работе использовали 3-дневные этиолированные побеги проростковозимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Иркутская озимая), озимой ржи(Secale cereale L., сорт Чулпан), кукурузы (Zea mays L., сорт Российская 1),выращенные на влажной фильтровальной бумаге при 26ºС. Всхожесть семянсоставляла 92-95,0%.Растительный материал подвергали кратковременной холодовой обработ-ке (-4ºС, 1 ч), холодовому закаливанию (4ºС, 7 сут), окислительному стрессу(0,5 мМ Н202, 4 ч), а также сочетанию кратковременной холодовой обработкис последующим окислительным стрессом и холодового закаливания с после-дующим окислительным стрессом.Митохондрии выделяли с помощью дифференциального центрифугирова-ния [16]. Очистку органелл проводили модифицированным методом в сту-пенчатом градиенте перколла, состоящем из 18, 23, 35% перколла [17]. Цело-Чувствительность дыхания и набухания митохондрий 121стность наружной мембраны очищенных митохондрий определяли по актив-ности цитохром с оксидазы (ЕС 1.9.3.1) [18] в отсутствии и присутствии0,04% Тритона Х-100.Активность митохондрий регистрировали полярографически с платино-вым электродом закрытого типа (электрод Кларка) в ячейке объемом 1,4 мл[19] на полярографе ОН-105 (Венгрия) при температуре 26-27ºС. Реакцион-ная среда для определения активности митохондрий содержала 18 мМКН2РО4 (рН 7,4), 125 мМ КСl, 1 мМ МgСl2 в присутствии 5 мМ ЭДТА или вего отсутствии. Использовали следующие субстраты окисления: 10 мМ ма-лат+10 мМ глутамат, 8 мМ сукцинат+5 мМ глутамат и 1 мМ НАДН.Полярограммы были использованы для расчёта скоростей фосфорили-рующего (состояние 3, V3) и нефосфорилирующего (состояние 4, V4) дыха-ния, коэффициента дыхательного контроля по Чансу-Вильямсу и отношенияАДФ:О [20]. Скорости дыхания в состояниях 3 и 4 выражали в нмольО2/(мин·мг митохондриального белка). Концентрацию митохондриальногобелка определяли в соответствии с методом Lowry с соавт. [21].Набухание выделенных митохондрий измеряли спектрофотометрическипри длине волны 540 нм на приборе СФ-26 (Россия). Измерение проводили ваэрируемой среде в кюветах объемом 2 мл при температуре 26ºС. Среда длянабухания содержала 200 мM KCl и 20 мM MOPS (pH 7,4). О набухании су-дили по падению оптической плотности митохондриальной суспензии(ОП540), данные рассчитывали в виде разницы оптической плотности(ΔОП540), равной (ОПt0-ОПt1)·100, где ОПt0 - начальная оптическая плот-ность, ОПt1 - оптическая плотность через определенное время.В качестве индукторов митохондриальной поры применяли ионы Ca2+ (всоставе CaCl2) (1,75 мМ) и пальмитиновую кислоту (50 мкМ). В качестве со-единений, изменяющих проницаемость митохондриальных мембран, исполь-зовали ЦА (1 мкМ) - специфичный ингибитор митохондриальной поры, кар-боксиатрактилозид (КАТ) (1 мкМ) - ингибитор АДФ/АТФ-антипортера, ГДФ(1 мМ) - ингибитор растительного разобщающего белка PUMP и 0,5%-ныйбычий сывороточный альбумин (БСА), связывающий СЖК. Инкубацию сионами Ca2+ и ЦА проводили при температуре 0ºС в течение 5 мин.Электрофорез белков в ПААГе с ДДС-Na проводили в блоках полиакри-ламидного геля в модифицированной системе Лэммли [22], используя прибордля электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD(США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану («Sigma», США)проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Опреде-ление молекулярных масс полипептидов проводили, используя в качествестандартов набор белков («Sigma», США).Все опыты проведены в 3-6 биологических повторностях. На рис. 1-7 ука-заны средние значения и их стандартные отклонения.Результаты исследованияЭДТА является одним из постоянных компонентов среды выделения ми-тохондрий. Он выполняет защитную функцию, т.к. является комплексообра-Н.122 С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимовазователем, связывающим ионы Са2+, которые освобождаются при разруше-нии ткани. Для изучения влияния ионов Са2+ и ЦА на скорость нефосфорили-рующего дыхания митохондрий разных видов растений, отличающихся постепени холодоустойчивости (озимая рожь, озимая пшеница и кукуруза), не-обходимо было проверить, как влияет исключение ЭДТА из сред промыва-ния, ресуспендирования и инкубации на чувствительность митохондрий куказанным реагентам.О влиянии индукторов и ингибиторов митохондриальной поры на функ-ционирование митохондрий озимой пшеницы судили по их действию на ско-рость нефосфорилирующего дыхания (состояние 4, V4). Это связано с тем, чтов основе механизма разобщения окислительного фосфорилирования лежитрост скорости дыхания в присутствии субстратов и в отсутствии АДФ [23].Митохондрии злаков, изолированные и инкубируемые в средах, содержа-щих ЭДТА, были нечувствительны к действию ЦА (рис. 1). Это позволяетпредположить, что на всех уровнях изоляции митохондрий происходит свя-зывание ионов Са2+, что является причиной отсутствия существенного влия-ния ЦА на скорость нефосфорилирующего дыхания.051015202530ОзимаяпшеницаОзимая рожь КукурузаСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаV4V4 + ЦАРис. 1. Влияние циклоспорина А (ЦА) на скорость нефосфорилирующего дыхания (V4)митохондрий озимой пшеницы, озимой ржи и кукурузы, выделенных в средах,содержащих ЭДТА, и инкубируемых в среде с ЭДТА. Субстрат окисления:10 мМ малат+10 мМ глутамат. Концентрация циклоспорина А (ЦА) равна1 мкМ, ионов Са2+ - 1,75 мМ и ЭДТА - 5 мМ. M±S.D., n = 3-6В то же время ЦА ингибировал нефосфорилирующее дыхание митохонд-рий, изолированных в средах с добавлением ЭДТА, но инкубируемых в егоотсутствии (рис. 2). Присутствие в инкубационной среде ионов Ca2+ приво-дило к увеличению скорости нефосфорилирующего дыхания при окислениимитохондриями малата и НАДН, т.е. ионы Ca2+ в этих условиях являлись ра-зобщающими агентами (рис. 2). Эта чувствительность была наибольшей вЧувствительность дыхания и набухания митохондрий 123митохондриях озимой пшеницы и кукурузы (рис. 2). Са2+-вызванная стиму-ляция скорости нефосфорилирующего дыхания ингибировалась добавлениемЦА при окислении малата и НАДН (рис. 2).В митохондриях, выделенных и инкубируемых в средах, не содержащихЭДТА, происходило увеличение скорости нефосфорилирующего дыхания вприсутствии ионов Са2+ при окислении всех используемых субстратов дыха-ния, которое было ЦА-чувствительно (рис. 3).Таким образом, действие специфичного ингибитора митохондриальнойпоры - ЦА - и ионов Са2+ - индукторов поры - наблюдали у митохондрийвсех изученных злаков как выделенных и инкубируемых в отсутствии ЭДТА,так и у митохондрий, только инкубируемых без ЭДТА. Полученные в работеданные позволяют говорить о существовании в митохондриях из этиолиро-ванных проростков озимой пшеницы, озимой ржи и кукурузы регулируемойСа2+-зависимой и ЦА-чувствительной поры.020406080100120Малат Сукцинат НАДНСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаV 4V 4 + ЦАV 4 + Са2+V 4 + Са2+ + ЦАОзимая пшеница020406080100120Малат Сукцинат НАДНСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаОзимая рожь020406080100120Малат Сукцинат НАДНСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаКукурузаРис. 2. Влияние циклоспорина А (ЦА) на скорость нефосфорилирующего дыхания (V4)митохондрий озимой пшеницы, озимой ржи и кукурузы, выделенных в средах,содержащих ЭДТА, и инкубируемых в отсутствии и присутствии ионов Са2+ в средебез ЭДТА. Субстраты окисления: 10 мМ малат+10 мМ глутамат, 8 мМ сукцинат+5 мМглутамат и 1 мМ НАДН. Концентрация циклоспорина А (ЦА) равна 1 мкМ,ионов Са2+ - 1,75 мМ и ЭДТА - 5 мМ. M±S.D., n = 3-6Н.124 С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. Побежимова01020304050607080Малат Сукцинат НАДНСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаV 4V 4 + ЦАV 4 + Са2+V 4 + Са2+ + ЦАОзимая пшеница01020304050607080Малат Сукцинат НАДНСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаОзимая рожь01020304050607080Малат Сукцинат НАДНСкорость поглощения кислорода,нмоль О2/мин мг белкаКукурузаРис. 3. Влияние циклоспорина А (ЦА) на скорость нефосфорилирующего дыхания (V4)митохондрий озимой пшеницы, озимой ржи и кукурузы, выделенных в средах,не содержащих ЭДТА, и инкубируемых в отсутствии и присутствии ионов Са2+в среде без ЭДТА. Субстраты окисления: 10 мМ малат+10 мМ глутамат, 8 мМсукцинат+5 мМ глутамат и 1 мМ НАДН. Концентрация циклоспорина А (ЦА)равна 1 мкМ, ионов Са2+ - 1,75 мМ. M±S.D., n = 3-6Этиолированные проростки злаков являются удобной моделью для изуче-ния механизмов ПКГ стареющего органа у растений. Показано, что в колеоп-тиле этиолированных проростков озимой пшеницы апоптоз происходит на 6-8-й день [15], а в первом листе - на 5-8-й день [24]. Поскольку процесс кле-точной гибели является генетически запрограммированным, то интереснобыло изучить изменение проницаемости митохондриальных мембран в при-сутствии индукторов и ингибиторов высокопроницаемой поры на более ран-них этапах развития проростков озимой пшеницы (в возрасте 3 дней).Изучение интактности наружной мембраны митохондрий, изолированныхиз проростков, не подвергнутых действию стрессовых факторов, и из проро-стков, подвергнутых низкотемпературному и окислительному воздействиям,показало ее высокие значения (от 94-99,0%). На хорошую сохранность изо-лированных митохондрий также указывают данные иммуноблоттинга мито-Чувствительность дыхания и набухания митохондрий 125хондриальных белков с антителами к цитохрому с. Во всех препаратах мито-хондрий обнаружено присутствие белка с мол. массой около 18 кД, в то вре-мя как в цитоплазматической фракции цитохрома с не обнаружено (рис. 4).Рис. 4. Иммуноблоттинг с поликлональными антителами на цитохром смитохондриальных белков из проростков озимой пшеницы, подвергнутыхстрессовым воздействиям. Электрофорез проводили в 15%-ном ПААГе с ДДС-Na.Обозначения: К - контроль, ХШ - кратковременное холодовое воздействие(-4ºС, 1 ч), ХШ+ОС - ХШ с последующим окислительным стрессом (0,5 мМ Н202, 4 ч),ХЗ - холодовое закаливание (4ºС, 7 сут), ХЗ+ОС - ХЗ с последующимокислительным стрессом, ОС - окислительный стресс (0,5 мМ Н202, 4 ч)020406080100120140160180200К ХШ ХЗ ОС ХШ+ОС ХЗ+ОСОтносительная скорость поглощения кислорода, %мтх+ЦАмтх+Са2+мтх+Са2+ + ЦАмтх+ПКмтх+ПК+ЦАРис. 5. Влияние ионов Са2+, пальмитиновой кислоты (ПК) и циклоспорина А (ЦА)на нефосфорилирующее дыхание (V4) митохондрий озимой пшеницы из контрольныхпроростков и проростков, подвергнутых стрессовым воздействиям. Субстрат окисления:10 мМ малат+10 мМ глутамат. За 100% принята скорость дыхания митохондрийв нефосфорилирующем состоянии в отсутствии ЦА, ионов Са2+ и ПК. Концентрацияциклоспорина А (ЦА) равна 1 мкМ, ионов Са2+ - 1,75 мМ и пальмитиновой кислоты(ПК) - 50 мкМ. M±S.D., n = 3-6. Обозначения см. на рис. 4Н.126 С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. ПобежимоваДыхание митохондрий из контрольных проростков озимой пшеницы ока-залось чувствительным к индукторам (ионы Ca2+ и пальмитиновая кислота) иингибитору (ЦА) митохондриальной поры (рис. 5), что позволило предполо-жить функционирование Са2+/пальмитат-зависимой и ЦА-чувствительнойпоры в митохондриях этих проростков.В то же время кратковременное и длительное холодовые воздействия напроростки озимой пшеницы изменяли чувствительность выделенных из нихмитохондрий к ЦА (рис. 5). Присутствие в инкубационной среде митохонд-рий ионов Ca2+ приводило к увеличению скорости нефосфорилирующего ды-хания (рис. 5). Однако наблюдаемое увеличение не ингибировалось ЦА(рис. 5). Пальмитиновая кислота вызывала стимуляцию скорости нефосфори-лирующего дыхания, которое было ЦА-чувствительно (рис. 5). Следующийза низкотемпературным окислительный стресс, вызываемый обработкой про-ростков озимой пшеницы перекисью водорода, приводил к появлению чувст-вительности дыхания митохондрий к ЦА (рис. 5).В экспериментах с инкубацией контрольных митохондрий озимой пшени-цы с ЦА обнаружили снижение набухания органелл (рис. 6). Так как извест-но, что накопление ионов Са2+ в митохондриях вызывает открытие высоко-проницаемых пор [10, 12, 25], было изучено влияние ионов Са2+ на набуханиемитохондрий озимой пшеницы, которые предварительно инкубировались сЦА и без него. Присутствие ионов Са2+ в инкубационной среде стимулирова-ло степень набухания митохондрий (рис. 6). Са2+-индуцированное набуханиеингибировалось после предварительной инкубации митохондрий с ЦА(рис. 6). Увеличение степени набухания контрольных митохондрий наблюда-ли и в присутствии пальмитиновой кислоты, действие которой было анало-гичным действию ионов Са2+ (рис. 6). Вызванное пальмитиновой кислотойнабухание было чувствительным к ЦА (рис. 6).При добавлении к митохондриям КАТ - ингибитора АДФ/АТФ-антипор-тера - наблюдали снижение набухания (рис. 7), что свидетельствует о том,что в набухании митохондрий озимой пшеницы принимает участиеАДФ/АТФ-антипортер. При добавлении БСА, связывающего СЖК, происхо-дило также уменьшение степени набухания митохондрий (рис. 7). В то времякак ГДФ - ингибитор растительного разобщающего белка PUMP - не оказы-вал влияния на набухание митохондрий озимой пшеницы (рис. 7).ЦА-чувствительная, Са2+- и пальмитат-зависимая стимуляция набуханиямитохондрий озимой пшеницы согласуется с данными, полученными приизучении влияния ЦА, ионов Са2+ и пальмитиновой кислоты на дыхание ми-тохондрий озимой пшеницы, которые также выявили ЦА-чувствительный,Са2+- и пальмитат-зависимый характер разобщения процессов окисления ифосфорилирования митохондрий. Поскольку набухание митохондрий являет-ся одним из показателей открытия высокопроницаемой митохондриальнойпоры, можно заключить, что наблюдаемое разобщение окислительного фос-форилирования и набухание митохондрий связаны с открытием митохондри-альной поры.Чувствительность дыхания и набухания митохондрий 127010203040506070К ХШ ХЗ ОС ХШ + ОС ХЗ + ОСРазница ОП 540 *100 через 5 минмтхмтх+ЦАмтх+Са2+мтх+ЦА + Са2+мтх+ПКмтх+ЦА + ПКРис. 6. Чувствительность набухания митохондрий озимой пшеницыиз контрольных проростков и проростков, подвергнутыхстрессовым воздействиям, к индукторам (ионы Са2+ ипальмитиновая кислота) и ингибитору (циклоспорин А)митохондриальной поры. Концентрация циклоспорина А (ЦА)равнялась 1 мкМ, ионов Са2+ - 1,75 мМ и пальмитиновой кислоты(ПК) - 50 мкМ. M±S.D., n = 3-6. Обозначения см. на рис. 405101520К ХШ ХЗ ОС ХШ+ОС ХЗ+ОСРазница ОП540*100 через 5 минмтх мтх+КАТ мтх+ГДФ мтх+БСАРис. 7. Чувствительность набухания митохондрий озимой пшеницыиз проростков, подвергнутых стрессовых воздействиям,к карбоксиатрактилозиду (КАТ), ГДФ и бычьемусывороточному альбумину (БСА). Концентрация ингибиторовсоставляла: 1 мкМ КАТ, 1 мМ ГДФ и 0,5% БСА. M±S.D., n = 3-6.Обозначения см. на рис. 4Н.128 С. Павловская, О.И. Грабельных, Т.П. ПобежимоваНабухание митохондрий из проростков, подвергнутых кратковременномуи длительному низкотемпературным воздействиям, было нечувствительно кдействию ЦА (см. рис. 6). Инкубация этих митохондрий с ионами Ca2+ сти-мулировала набухание, которое было также ЦА-нечувствительно (см. рис. 6).Индукция набухания митохондрий в присутствии пальмитиновой кислотыбыла менее выражена, по сравнению с эффектом этой кислоты в митохонд-риях, изолированных из контрольных проростков. Набухание митохондрий,вызванное действием пальмитиновой кислоты, полностью ингибировалосьЦА (см. рис. 6). При добавлении КАТ и ГДФ к митохондриям, изолирован-ным из проростков, подвергнутых кратковременному холодовому воздейст-вию, происходило снижение набухания (см. рис. 7). Добавление БСА к мито-хондриям не изменяло степень их набухания (см. рис. 7). Снижение степенинабухания митохондрий под действием ингибиторов АДФ/АТФ-антипортераи разобщающего белка PUMP указывает на вклад этих белков в ответ накратковременное холодовое воздействие. Если в митохондриях контрольныхпроростков действие ГДФ на набухание отсутствовало, то его влияние на на-бухание митохондрий из проростков, подвергнутых холодовому стрессу, ука-зывает на важную роль разобщающего белка PUMP в условиях стресса. От-сутствие влияния БСА на набухание митохондрий объясняется увеличениемво время холодового стресса содержания СЖК и тем, что используемой кон-центрации БСА оказывается недостаточно для их связывания.Действие КАТ в митохондриях из закаленных в холоде проростков былоаналогичным его эффекту в митохондриях из проростков, подвергнутыхкратковременному холодовому воздействию (см. рис. 7). Добавление ГДФ кмитохондриям закаленных проростков не изменяло степень их набухания,тогда как БСА снижал степень набухания митохондрий из закаленных проро-стков (см. рис. 7). Эти данные указывают на то, что при холодовом закалива-нии в набухании митохондрий озимой пшеницы, обусловленном действиемСЖК, принимает участие АДФ/АТФ-антипортер.Набухание митохондрий из проростков, подвергнутых окислительномустрессу как самому по себе, так и после действия низких температур, так жекак и набухание митохондрий из контрольных проростков, ингибировалосьЦА. Присутствие ионов Ca2+ и пальмитиновой кислоты не вызывало стимуля-ции набухания митохондрий. КАТ и БСА вызывали снижение степени набуха-ния, в то время как ГДФ не оказывал влияния (см. рис. 7). Снижение набуханияпод действием КАТ наряду с действием БСА в митохондриях озимой пшеницыиз проростков, подвергнутых действию окислительного стресса, указывает нароль АДФ/АТФ-антипортера в набухании, обусловленном СЖК.Обсуждение результатов исследованияМитохондрии, являясь одним из центров регуляции энергетического ме-таболизма, играют ключевую роль в ответе растений на стрессовые воздейст-вия, а

Скачать электронную версию публикации