Dynamics of trypsin inhibitor activityin Hedysarum theinum Krasnob. (Fabaceae Lindl.) plant leaves in differentec.pdf ВведениеКопеечник чайный (Hedysarum theinum Krasnob.) - редкое для Сибирирастение, занесенное в Красную книгу Республики Алтай [1]. Он был вы-делен из копеечника забытого (Hedysarum neglectum Ledeb.) как самостоя-тельный вид [2]. Встречается в пределах Горного Алтая в достаточно узкомдиапазоне экологических условий - в пределах высокогорного пояса рас-тительности, в прилегающих районах лесного пояса на альпийских, субаль-пийских и лесных лугах, на каменистых склонах [3]. Вид активно заготав-ливается в природе, поскольку содержит группу фенольных соединений внадземной части и корнях и активно используется в народной медицине[4, 5]. H. theinum успешно интродуцирован в Сибирском ботаническом садуТГУ (СибБС ТГУ, г. Томск), где выращивается с 1993 г. из семян, собран-ных с хребта Холзун (Республика Алтай, Усть-Канский район) в кедрово-лиственничном редколесье С.Б. Нечепуренко из Центрального сибирскогоботанического сада СО РАН (ЦСБС СО РАН, г. Новосибирск). H. theinumшироко используется в народной медицине как сырье для лекарственныхпрепаратов, одним из которых является мангиферин, проявляющий проти-вовирусную активность.Растения H. theinum содержат значительное количество кормового бел-ка и являются его потенциальными источниками. В нем обнаружена высо-кая активность таких антиалиментарных веществ, как ингибиторы трипси-на (ИТ), которые в значительной степени снижают его перспективность вкачестве кормового растения [6]. Ингибиторы протеиназ (ИП) составляютгруппу белков растений, объединяемых общей способностью образовыватьс протеолитическими ферментами стереохимические белок-белковые ком-плексы, что приводит к конкурентному ингибированию их каталитическойактивности. ИТ в организме человека и животных взаимодействуют с трип-сином, который в результате теряет каталитическую активность и возмож-ность расщеплять белки; происходит снижение процесса гидролиза белковпищи и эффективности их усвоения, что способствует резкому снижениюактивности секрета поджелудочной железы. В результате белок не усваива-ется организмом, что приводит к обострению его дефицита.Среди растений особенно высоким содержанием белков-ингибиторовпротеиназ характеризуются представители семейства бобовых [7]. ИТ всеменах являются запасными белками, выступают в роли регуляторов ак-тивности эндогенных протеиназ и являются составной частью защитнойсистемы растений, способствуя подавлению активности протеиназ насеко-мых-вредителей и патогенной микрофлоры [8-14]. ИТ в растениях отно-сятся к белкам группы PR-6 (pathogenesis-related proteins, PR-proteins) [15],синтез которых индуцируется в патологических или сходных с патологи-ческими стрессовых ситуациях, например при холодовых воздействиях,инфицировании микроорганизмами или внедрении патогенов [16-19]. Та-ким образом, активность ИТ в растениях играет важную адаптивную роль,которая изучена недостаточно для растений разных групп, а тем более дляредких видов.В медицинской практике ИТ применяют при лечении различных вос-палительных заболеваний, где имеет место повышенная активность про-теолитических ферментов; создаются лекарственные средства на основеингибиторов протеиназ синтетического и животного происхождения [20].Проводится поиск растительных источников ингибиторов протеиназ с це-лью создания лекарственных средств для лечения, например, энзимопатий,сопровождающихся повышенной активностью протеолитических фермен-тов [21]. H. theinum может быть использован в качестве кормовой добавки свысоким содержанием биологически-активных веществ или может служитьисточником растительного сырья с высокой трипсинингибирующей актив-ностью, предназначенного для использования в медицинских целях [6].Целью данной работы является анализ сезонной и годичной динамикиАИТ в листьях растений H. theinum в различных эколого-географическихусловиях и при механическом повреждении растений.Материалы и методики исследованияИсследование годичной динамики активности водорастворимых ингиби-торов трипсина (АИТ) в листьях H. theinum в СибБС ТГУ было проведенонами в средних образцах у растений средневозрастного онтогенетическогосостояния 4-6 лет жизни (2009-2011 гг., соответственно в трех повторно-стях для каждого опыта). В 2010 г. изучена, кроме того, сезонная динами-ка признака при интродукции в СибБС ТГУ (г. Томск), в ЦСБС СО РАН(г. Новосибирск) и в Горном Алтае (Усть-Коксинский район, подножие горыКрасная). В 2010 г. в СибБС ТГУ (фаза бутонизации) и в Горном Алтае (фазаплодоношения) изучена динамика индивидуальной изменчивости признакав растениях при их механическом повреждении (отчуждении листьев), ис-следованная в обоих случаях на пяти средневозрастных особях. Листья сры-вались с каждого растения через определенные интервалы времени - 1, 3, 5,10 и 15 мин. Динамика АИТ при механическом повреждении определяласьиндивидуально для каждой особи в трех повторностях. АИТ определяли вмиллиграммах чистого трипсина, связанного ингибитором, на грамм воз-душно-сухой муки листьев по методам [22, 23] с дополнениями [24]. Стати-стическая обработка данных (вычисление средней величины, ошибки сред-ней и построение соответствующих графиков) проведена с использованиемпакета программ «MS Excel».Для определения использовали следующие реактивы: раствор трипсина в0,001 н HCl; стандартный трис-HCl 0,02 M CaCl2 - буфер (рH 7,7); раствор N-α-бензоил-DL-аргинин р-нитроанилида (БАПА) (производство США); 30%-ныйраствор ледяной уксусной кислоты. Все растворы хранили в холодильнике неболее двух недель. Муку из листьев получали, растирая воздушно-сухое сырьев ступке и просеивая ее через сито с диаметром ячейки 0,1 мм. Исследуемыевещества из муки экстрагировали дистиллированной водой в соотношении1:400 в течение ночи в холодильнике; полученный экстракт центрифугировалив течение 30 мин при 7 000 g (не менее 11 000 об./мин). Определение активно-сти ингибиторов трипсина проводили при 25°C в полученной надосадочнойжидкости (НЖ), для чего прогревали все реактивы и НЖ предварительно втермостате в течение часа. К различным объемам НЖ (0,01-0,20 мл) при-ливали 1,5 мл стандартного буфера и 0,5 мл раствора трипсина. По истече-нии 5 мин по секундомеру добавляли 1 мл раствора БАПА. Через 10 минреакцию останавливали, добавляя 0,5 мл раствора CH3COOH. Параллельнопроводили определение активности чистого трипсина. Для этого к 0,01-0,20 мл экстрагента (дистиллированная вода) добавляли 1,5 мл стандарт-ного буфера и 0,5 мл раствора трипсина. По истечении 5 мин добавлялираствор БАПА. Через 10 мин реакцию останавливали 30%-ной уксуснойкислотой. Одновременно готовили контрольные растворы, для чего в кон-трольные пробирки добавляли раствор CH3COOH сразу после внесениянадосадочной жидкости и буферного раствора. При построении графикапрохождения реакции использовали разные объемы надосадочной жидко-сти. Для определения величины АИТ использовали данные, полученныепри ингибировании трипсина, близком к половинному [23].Результаты исследования и обсуждениеПроведенное нами изучение годичной динамики АИТ в листьях расте-ний H. theinum показало, что активность ИТ в листьях растений этого видав СибБС ТГУ в 2009 и 2011 гг. была наибольшей по сравнению с другимиранее исследованными видами [24]. Нами обнаружено, что АИТ в листьяхсредневозрастных растений изучаемого вида в фазе цветения в 2010 г. былав среднем в 3 раза ниже, чем в 2009 г. Основываясь на ранее полученныхрезультатах, максимальной АИТ характеризовались растения одной из по-пуляций H. gmelinii, произраставшей в Горном Алтае (65,5 мг/г сухого веса)[25, 26]. Также выявлено, что АИТ в листьях H. theinum в культуре в 2009и 2011 гг. была сопоставима с величиной этого признака в исследованныхранее семенах сои (90-250 мг/г сухого веса), которые являются эталоном[25]. АИТ этих образцов равнялась 132±15,4 мг/г сухого веса муки листьевв фазе плодоношения в 2009 г. и в фазе цветения в 2011 г. - 83,1 мг/г сухоговеса муки листьев соответственно (рис. 1).Сезонная динамика АИТ в листьях H. theinum в СибБС ТГУ отлича-лась от выявленной ранее активности для других бобовых растений. Так,в листьях интродуцированных в ЦСБС СО РАН некоторых видов бобовыхрастений величина АИТ понижалась к фазе плодоношения [25, 27]. Понашим данным, в листьях интродуцированного в СибБС ТГУ H. theinumвеличина признака была наименьшей в фазе цветения и увеличивалась вфазе плодоношения растений. Такая сезонная динамика признака, когдаминимальное его значение приходилось на фазу цветения, сохранялась втечение двух лет наблюдений (2009 и 2010 гг.) (рис. 1). Сравнение вели-чины и динамики признака в средневозрастных растениях с природнымиобразцами, интродуцированными в ЦСБС СО РАН, проведенное в 2010 г.,показало, что в этом году величина АИТ в фазе цветения была наиболь-шей в природных условиях и на эту фазу приходилось максимальное зна-чение признака. Такой же динамикой АИТ характеризовались растениявида, интродуцированные в ЦСБС СО РАН, где величина этого признакабыла вдвое ниже, но его максимум приходился также на фазу цветениярастений (рис. 1).0,0020,0040,0060,0080,00100,00120,00140,00Бутонизация Цветение ПлодоношениеФаза фенологического развитияАктивность ингибиторов трипсина, мг/гГорн.Алтай, 2010 г. СибБС ТГУ, 2010 г.ЦСБС СО РАН, 2010 г. СибБС ТГУ, 2009 г.Рис. 1. Годичная и сезонная динамика АИТ в средних образцах листьев средневозрастных растенийH. theinum в различных эколого-географических условиях, 2009-2010 гг.Нами впервые в 2010 году была исследована динамика АИТ в растениях H. theinum при механическомповреждении (отчуждении листьев). Она была неодинаковой в растениях в фазе бутонизации (СибБС ТГУ) и плодоношения ( Горный Алтай). Так, в фазе бутонизации, в 4 растениях из 5 АИТ возросла в течение минуты в 1,1-2,4 раза по сравнению с контролем; через 5 мин. ее значения были выше контрольных в 1,3-2,9затем активность незначительно снизилась и через 15 мин. после первого повреждения оставалась на уровне1,2-1,9 раза выше контрольного (рис. 2)20304050607080Контроль 1 3 5 10 15Время, мин.Активность ингибиторов трипсина, мг/гРис. 1. Годичная и сезонная динамика АИТ в средних образцахлистьев средневозрастных растений H. theinum в различныхэколого-географических условиях, 2009-2010 гг.Нами впервые в 2010 г. была исследована динамика АИТ в растенияхH. theinum при механическом повреждении (отчуждении листьев). Она быланеодинаковой в растениях в фазе бутонизации (СибБС ТГУ) и в фазе плодо-ношения (Горный Алтай). Так, в фазе бутонизации в 4 растениях из 5 АИТвозросла в течение 1 мин в 1,1-2,4 раза по сравнению с контролем; через5 мин ее значения были выше контрольных в 1,3-2,9 раза, затем активностьнезначительно снизилась и через 15 мин после первого повреждения оста-валась на уровне в 1,2-1,9 раза выше контрольного (рис. 2).В фазе плодоношения в природных условиях характер изменчивости при-знака в растениях H. theinum при механических повреждениях отличался отпредыдущего опыта (рис. 3). Так, АИТ в течение минуты после повреждениявозросла в двух растениях из пяти в 1,7 и 3,5 раза, а в трех других растенияхне изменилась. Через 5 мин в листьях всех исследуемых особей произошлоее увеличение в 1,2-4 раза. К десятой минуте после повреждения растенийзначения АИТ уменьшились в 1,3-7,8 раза во всех растениях, в одном изних - до нуля (растение 5). Через 15 мин АИТ восстановилась до первона-чального уровня, превысив в растении № 5 исходную величину в 5,5 раза.Таким образом, установлено, что каждое растение на механическое по-вреждение реагировало индивидуально. Очевидно, что средняя величина неотражает характер реакции каждого из растений на повреждение. Общимдля реакции растений на повреждение в фазе бутонизации было сохранениевысокого уровня АИТ через 15 мин после повреждения.20304050607080Контроль 1 3 5 10 15Время, мин.Активность ингибиторов трипсина, мг/гВремя, минРис. 2. Динамика АИТ при механическом повреждении растений H. theinum(СибБС ТГУ, 2010 г., фаза бутонизации). Здесь и далее линиямипоказаны реакции отдельных особей; на линии средней величиныпоказано среднее значение признака с ошибкой02468101214161820Контроль 1 3 5 10 15Активность ингибиторов трипсина, мг/гВремя, минРис. 3. Динамика АИТ при механическом повреждении растений H. theinum(Горный Алтай, 2010 г., фаза плодоношения)Ранее было показано, что в растениях копеечника альпийского в ЦСБССО РАН во время цветения АИТ в растениях увеличивалась почти в 2 разав течение 5 мин после механического повреждения растений и уже через15 мин возвращалась к контрольным значениям, что указывает на активноеучастие ИТ в защитных реакциях растений при механических повреждени-ях [28]. В растениях H. theinum в фазе плодоношения во всех исследованныхособях произошло резкое снижение АИТ, наблюдавшееся через 10 мин по-сле начала эксперимента, что, вероятно, свидетельствует об определенномснижении их защитных сил, наступившее в конце вегетационного периода.ЗаключениеНами выявлено, что в растениях H. theinum на протяжении вегетацион-ного периода наблюдалась неодинаковая динамика АИТ в разных эколого-географических условиях, что свидетельствует о реализации различныхприспособительных реакций у растений. При механических поврежденияхих надземной части каждое растение реагирует индивидуально, но общимявляются увеличение АИТ в первые минуты после отчуждения листьев ивозвращение на уровень, близкий к контролю, либо иногда сохранение егона уровне незначительно выше контрольного через 15 мин после первогосрывания листьев. Индукция ингибиторов протеиназ, в частности трип-сина, сопровождающаяся усилением их активности, происходит, крометого, при некрозах тканей, в том числе наступивших, например, из-за низ-котемпературного воздействия и при повреждении насекомыми [13, 18].Очевидно, что при механическом повреждении ткани неизбежно проис-ходит инфицирование, поэтому рассматривать отдельно такие стрессовыедля растения воздействия, как повреждение насекомыми, патогенами, низ-кими температурами или поранение, в данном случае не представляетсявозможным. Характер реакции каждого из растений на эти воздействия неоднотипен и судить о процессах восстановления целостности организмапо уровню средних значений признака было бы некорректно.Таким образом, механическое повреждение, а именно отчуждение ли-стьев, является удобной моделью

Скачать электронную версию публикации