Antagonistic potential of siberian strains of Bacillus spp. towards agents causing animal and plant diseases.pdf Введение Спорообразующие бактерии рода Bacillus являются продуцентами широкого спектра биологически активных веществ (БАВ), в том числе ферментов, липопептидных и других антибиотиков, спектр которых зависит от геогра фического происхождения изолятов [1, 2]. Продукция БАВ обусловливает высокую бактерицидную и бактериостатическую активность Bacillus spp. в отношении патогенных грамположительных (Clostridium spp., Corynebacte-rium spp., Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Treponema pallidum, Neisseria meningitis) бактерий [3], а также фунгицидную (фунгистатическую) активность в отношении фитопатогенных грибов - Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Aspergillus niger [4, 5]. Таким образом, представители рода Bacillus обладают бактерицидной и фунгицидной активностью и рассматриваются как перспективные биологические агенты для создания противомикробных препаратов. Пробиотики на основе бактерий B. subtilis успешно применяют в медицине для терапии инфекций различной этиологии [6-8]. В ветеринарной медицине препараты и кормовые добавки, включающие в качестве действующего начала бактерии рода Bacillus, используют для снижения падежа, повышения привесов, снижения конверсии кормов в свиноводстве [9, 10], птицеводстве [11], при выращивании крупного рогатого скота [12]. В защите растений от возбудителей болезней была показана эффективность штаммов B. subtilis в качестве биофунгицидов для культур открытого и защищенного грунта [13, 14], а также в технологии хранения овощей [15]. Цель работы - оценить антагонистическую активность сибирских природных штаммов бактерий рода Bacillus как потенциальной основы биопрепаратов для управления здоровьем животных и растений. материалы и методики исследования Культуры микроорганизмов. Штаммы бактерий-антагонистов патогенной микрофлоры - Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus licheni-formis - были выделены из почвы лесных биоценозов Новосибирской области и депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва) и Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany). Чистые культуры фитопатогенных грибов (Bipolaris sorokiniana ВКПМ В-532, Botrytis cinerea ВКПМ В-1006, Fusarium graminearum ВКПМ В-147, Fusar-ium solani ВКПМ В-163, Fusarium chlamydosporum ВКПМ В-899, Fusarium oxysporum ВКПМ В-349, Fusarium avenacium ВКПМ В-623) были получены в ВКПМ. Остальные тест-объекты (штаммы Alternaria solani A7 АКТЛ 112, А7 НКЛ 2в, А7 АКТЛ 125 3б, Botrytis cinerea M-01, M-4-2, Fusarium solani К 6, Phytophthora infestans, расы 3,4 и 1-11) выделены авторами из инфицированных растений, а чистые культуры патогенных бактерий (Candida albicans, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosae, Salmonella enterica subsp. enterica serovar choleraesuis, Salmonella enterica subsp. enterica serovar enteritidis, Salmonella enterica subsp. enterica serovar paratyphi B, Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhimurium, Shigella sonnei, Shigella flexneri IIa, Staphylococcus aure-us) - из патологического органного материала, полученного от павших сельскохозяйственных животных (молодняк крупного рогатого скота, свиньи). Изучение антагонизма. Антагонистическую активность в отношении патогенов определяли методом перпендикулярных штрихов на чашках Петри с мясо-пептонным агаром (МПА, Meat Infusion Agar (Standart Infusion Agar), HiMedia) и выражали в мм зоны полного угнетения роста патогена [16]. Для оценки антагонистической активности штаммов в отношении C. albicans, с целью формирования одинаково благоприятных условий для роста и развития и патогена, и штамма-антагониста, в МПА добавляли 1% глюкозы (a-D глюкоза (декстроза) моногидрат, Cerestar). Испытуемый штамм бактерии-антагониста высевали штрихом (полоской) по диаметру чашки Петри с МПА, посевы инкубировали в термостате при температуре (37+0,5)°С в течение 48+1 ч. По окончании времени инкубации перпендикулярно к штриху антагониста подсевали тест-культуры патогенов, после чего посевы помещали в термостат при указанной ранее температуре еще на 20+1 ч. Если изучаемый штамм-антагонист оказывал антимикробное действие в отношении изучаемых патогенов, то последние росли на расстоянии от его штриха, которое и являлось количественной мерой антагонистической активности. Антагонистическую активность в отношении фитопатогенов определяли модифицированным методом агаровых блоков и выражали в виде ингибирующей активности [17]. Фитопатогенные грибы выращивали на картофельно-глю-козном агаре. Поверхность агаризованной питательной среды в чашках Петри засевалась бактериальными штаммами для получения равномерных газонов. Чашки инкубировали 48 ч при 28°С, затем на их поверхность в центр помещали грибные блоки диаметром 1 см, вырезанные из колоний грибов. В контроле среда использовалась без внесения бактерий. Измерение диаметров выросших грибных колоний проводилось на 5 сутки сокультивирова-ния при 25°С. Ингибирующую активность вычисляли, исходя из диаметров колоний в контрольном и опытном вариантах, по формуле (Дк-До)/Дк, где Дк - диаметр колоний в контроле, До - в опыте, выражая в %. Данные в таблицах представлены в виде средней арифметической с доверительными интервалами. Статистическая обработка полученных данных выполнена в программе StatSoft STATISTICA for Windows 6.0. Результаты исследования и обсуждение Анализ антагонистической активности в отношении патогенных бактерий. Результаты определения антагонистической активности изученных штаммов в отношении патогенов представлены в табл. 1. В зависимости от ширины зоны угнетения роста микробных тест-объектов можно выделить высокую (от 11 до 30 мм), среднюю (в пределах 4-10 мм) и слабую (до 4 мм) антагонистическую активность. Наибольшее антагонистическое действие бацилл отмечено в отношении St. aureus. Т а б л и ц а 1 Антагонистическая активность бактерий в отношении патогенов, зона угнетения роста, мм Наименование патогенного тест-микроорганизма Штаммы бактерий-антагонистов Bs-1 Ba-1 Ba-2 Bl-1 Bl-2 Bl-3 Bl-4 C. albicans 359 18+2,35 20+3,06 20+3,12 5+0,49 4+1,08 5+0,54 12+1,41 C. albicans 604 12+0,87 30+2,19 13+1,50 8+0,76 10+0,82 10+0,90 6+0,54 C. albicans 616 30+2,28 30+2,06 15+2,04 10+1,88 10+1,16 5+0,66 6+0,49 C. freundii 1 2+0,12 5+0,27 7+0,60 2+0,17 2+0,28 2+0,09 2+0,32 C. freundii 2 4+0,40 5+0,61 5+0,58 2+0,20 3+0,44 2+0,18 4+0,60 C. freundii 17 10+0,70 5+0,56 5+0,70 2+0,19 2+0,22 3+0,30 4+0,41 E. coli 582 6±0,61 8+0,72 10+0,86 2+0,13 2+0,21 2+0,24 2+0,20 E. coli 2 6+0,44 10+1,09 10+1,23 2+0,33 2+0,30 2+0,22 2+0,38 E. coli 457 7+0,50 6+1,15 11+1,42 2+0,28 3+0,46 3+0,51 5+0,67 K. pneumonia 995 1+0,11 9+0,94 15+1,63 6+1,06 4+0,53 3+0,40 4+0,59 K. pneumonia 47 8+0,61 8+0,70 8+0,65 6+0,49 5+0,44 6+0,56 0 K. pneumonia 3/3 5+0,40 5+0,33 6+0,44 5+0,37 4+0,22 2+0,19 2+0,20 P. vulgaris 14 6+0,59 3+0,27 6+0,65 2+0,20 4+0,39 2+0,30 0 P. vulgaris 222 7+0,84 7+0,69 6+0,70 29+1,39 10+1,06 12+1,11 10+0,90 P. vulgaris 88 6+0,70 7+0,84 10+0,93 3+0,12 3+0,29 2+0,21 2+0,31 P. aeruginosa 884 15+1,04 2+0,19 6+0,70 3+0,31 2+0,22 2+0,19 2+0,34 P. aeruginosa 17 8+0,92 2+0,20 6+0,45 3+0,41 3+0,32 4+0,57 4+0,60 P. aeruginosa 12 2+0,12 4+0,30 3+0,32 3+0,27 4+0,36 3+0,19 3+0,29 Salmonella enterica subsp. enterica serovar choleraesuis 5+0,40 6+0,53 6+0,50 5+0,44 2+0,20 2+0,23 3+0,31 Salmonella enterica subsp. enterica serovar enteritidis 8+0,66 13+1,14 30+1,43 20+1,70 20+1,65 18+1,40 20+1,59 Salmonella enterica subsp. enterica serovar paratyphi B 5+0,39 7+0,69 6+0,65 2+0,15 2+0,22 2+0,13 3+0,31 Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhimurium 5+0,41 10+1,02 10+1,14 4+0,52 3+0,33 3+0,30 2+0,20 Sh. sonnei 7+0,60 11+0,97 7+0,60 10+1,06 10+1,14 2+0,16 4+0,24 Sh. flexneri Ila 12+0,71 21+1,48 18+2,03 4+0,44 2+0,35 2+0,30 2+0,19 St. aureus 209 22+1,36 20+1,19 25+1,46 27+1,66 20+1,39 26+1,40 20+1,06 St. aureus 211 23+1,41 24+1,56 25+1,17 28+1,69 22+1,54 24+1,19 20+1,05 St. aureus 12 24+1,70 30+2,48 29+2,07 30+1,90 24+1,27 30+1,90 22+1,88 Высокой активностью в отношении C. albicans обладали штаммы B. sub-tilis ВКПМ В-16041, DSM 24613 (далее по тексту Bs-1), B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, DSM 24614 (далее по тексту Ba-1) и B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, DSM 24615 (далее по тексту Ba-2). Остальные штаммы бацилл проявили к данному патогену среднюю антагонистическую активность. Т а б л и ц а 2 ингибирующая активность бактерий в отношении фитопатогенов, % Наименование фитопатогенного тест-микроорганизма Штаммы бактерий-антагонистов Bs-1 Ba-1 Ba-2 Bl-1 Bl-2 Bl-3 Bl-4 A. solani A7 АКТЛ 112 68,5+1,19 71,4 +2,07 71,4+1,55 71,4+1,80 65,7+2,19 68,6+2,23 37,1+1,07 A. solani А7 НКЛ 2в 66,7+2,09 50,0 +1,85 56,7+1,90 66,7+2,44 66,7+2,70 66,7+2,19 66,7+2,17 A solani А7 АКТЛ 125 3б 66,7+2,03 66,7 +2,12 66,7+2,09 66,7+2,11 66,7+2,10 66,7+2,09 60,0+1,90 B. sorokiniana ВКПМ В-532 81,8+2,49 81,8 +2,29 81,8+2,47 36,4+1,16 41,8+1,50 67,3+2,07 27,3+1,26 B. cinerea M-01 62,5+1,92 62,5 +2,05 62,5+2,13 53,3+1,88 51,1+1,80 55,6+1,94 22,2+0,98 B. cinerea ВКПМ В-1006 50,0+2,24 50,0 +2,17 50,0+2,01 0 0 0 0 B. cinerea M-4-2 68,7+2,30 68,7 +2,46 68,7+2,41 68,8+2,03 48,6+2,11 68,7+1,95 37,5+0,88 Fusarium graminearum ВКПМ В-147 54,5+1,74 54,5 ±1,83 54,5+1,80 50,0+1,75 31,8+1,40 45,4+1,66 31,8+1,19 Fusarium solani ВКПМ В-163 44,4+1,33 44,4 +1,40 44,4+1,37 0 0 33,3+1,18 0 A. solani A7 АКТЛ 112 68,5+2,20 71,4 +2,69 71,4+2,55 71,4+2,71 65,7+2,38 68,6+2,30 37,1+1,15 A. solani А7 НКЛ 2в 66,7+2,07 50,0 +1,92 56,7+1,84 66,7+2,04 66,7+2,12 66,7+2,29 66,7+2,31 A. solani А7 АКТЛ 125 3б 66,7+2,18 66,7 +2,81 66,7+2,60 66,7+2,55 66,7+2,74 66,7+2,15 60,0+2,18 B. sorokiniana ВКПМ В-532 81,8+2,96 81,8 +2,70 81,8+2,66 36,4+1,18 41,8+1,60 67,3+2,00 27,3+0,93 B. cinerea M-01 62,5+2,45 62,5 +1,97 62,5+2,17 53,3+1,70 51,1+1,64 55,6+1,50 22,2+0,98 B. cinerea ВКПМ В-1006 50,0+1,74 50,0 +1,66 50,0+1,54 0 0 0 0 B. cinerea M-4-2 68,7+2,15 68,7 +2,26 68,7+2,33 68,8+2,40 48,6+1,83 68,7+2,01 37,5+1,14 Fusarium graminearum ВКПМ В-147 54,5+1,59 54,5 +1,60 54,5+1,83 50,0+1,19 31,8+1,62 45,4+1,18 31,8+0,87 Fusarium solani ВКПМ В-163 44,4+0,75 44,4 +1,13 44,4+1,04 0 0 33,3+0,60 0 Fusarium chlamydosporum ВКПМ В-899 76,2+2,29 76,2 +2,61 64,3+2,16 52,4+1,67 47,6+1,32 61,9+1,70 16,7+0,29 Fusarium solani К 6 68,9+2,09 77,8 +2,73 77,8+2,44 40,0+1,90 40,0+1,33 48,9+1,12 0 Fusarium oxysporum ВКПМ В-349 76,2+2,09 76,2 +2,40 76,2+2,33 47,6+2,19 64,3+1,96 52,4+1,47 23,8+0,85 Fusarium avenacium ВКПМ В-623 76,1+2,44 76,2 +3,85 76,2+2,41 59,5+1,94 64,3+1,87 64,3+2,03 23,8+0,70 Ph. infestans расы 3,4 80,0+2,55 80,0 +2,79 80,0+2,64 66,0+1,95 66,0+2,04 68,0+2,17 50,0+1,03 Ph. infestans расы 1-11 70,0+2,69 75,0 +2,70 75,0+2,13 62,5+1,98 57,5+1,72 67,5+2,03 25,0+0,81 Все штаммы показали наличие бактерицидного действия средней и слабой степени в отношении других использованных в опыте грамотрицатель-ных бактерий - C. freundii, E. coli, K. pneumonia, P. vulgaris, P. aeruginosa, Salmonella sp., Sh. sonnei, Sh. flexneri IIa. Зона угнетения роста составляла в среднем 2-10 мм в зависимости от вида тест-объекта. Таким образом, все изученные штаммы бактерий B. subtilis, B. amyloliq-uefaciens и B. licheniformis подавляли рост патогенных бактерий, хотя и в различной степени. Анализ антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов. Штаммы бактерий-антагонистов проявили ингибирующие свойства в отношении большинства использованных в опыте фитопатогенов (см. табл. 2). На возбудителя альтернариоза A. solani наибольшее ингибирующее действие оказали штаммы B. amyloliquefaciens Ba-1 и Ba-2, B. licheniformis ВКПМ В-10561, DSM 24609 (далее по тексту Bl-1) и B. subtilis Bs-1. В подавлении роста возбудителя корневых гнилей B. sorokiniana высокую активность проявили штаммы B. subtilis Bs-1, B. amyloliquefaciens Ba-1 и Ba-2. Эти же штаммы были максимально активными по сравнению с остальными по отношению к возбудителю серой гнили растений B. cinerea. В то же время установлено, что штаммы B. licheniformis не подавляли роста B. cinerea (штамм ВКПМ В-1006). Против фитопатогенных грибов рода Fusarium и возбудителя фитофтороза пасленовых культур Ph. infestans все изученные нами бактерии Bacillus spp. показали высокий уровень ингибирующей активности. У бактерий B. licheniformis Bl-1; ВКПМ В-10562, DSM 24610 (далее по тексту Bl-2) и ВКПМ В-10564, DSM 24612 (далее по тексту Bl-4) отсутствовала антагонистическая активность в отношении F. solani ВКПМ В-163. Проведенные исследования показали, что помимо бактерицидного действия, которое штаммы B. subtilis, B. amyloliquefaciens и B. licheniformis оказывали на патогенные бактерии, они проявляют ингибирующую активность в отношении фитопатогенных грибов. Ряд авторов указывал на подобное антибактериальное и фунгистатическое действие спорообразующих бактерий [18-21]. Как отмечено выше, это связано с тем, что перечисленные бактерии в процессе жизнедеятельности выделяют антимикробные вещества широкого спектра действия [22, 23]. Поэтому спорообразующие бактерии применяют в качестве действующего начала как лекарственных препаратов [24, 25], так и экологически безопасных средств защиты растений от болезней [26, 27]. Нами установлено наличие антагонизма изученных штаммов бактерий рода Bacillus в опытах in vitro в отношении бактерий - возбудителей болезней животных и человека - C. freundii, E. coli, K. pneumonia, P. vulgaris, P. aeruginosa, Salmonella sp., Sh. sonnei, Sh. flexneri IIa, St. aureus и C. albicans. Что касается антагонистической активности в отношении фитопатогенных грибов, то добавление изученных штаммов в питательную среду подавляло рост опасных возбудителей болезней растений A. solani, B. sorokiniana, Ph. infestans и грибов рода Fusarium в большей или меньшей степени в зависимости от штамма тест-микроорганизма. Для одного из использованных в эксперименте штаммов - B. cinerea ВКПМ В-1006 - не выявлено ингиби-рующего действия со стороны бактерий-антагонистов B. licheniformis. Наши результаты согласуются с данными, полученными другими авторами в работах, касающихся патогенных бактерий Corynebacterium diphteriae, St. aureus, Streptococcus haemolyticus, P. aeruginosa [28] и фитопатогенных грибов [29, 30]. Так, Н.И. Габриэлян с соавторами [28] показали, что штамм бактерии B. subtilis, входящий в состав препарата споробактерин, обладает высокой антагонистической активностью в отношении стафилококков (St. aureus, St. epidermidis, St. saprophyticus), дрожжеподобных грибов Candida spp. и энтерококков (Enterococcus faecium). В то же время авторы отмечают, что среди изученных штаммов другого вида энтерококка - E. faecalis - лишь 50% были чувствительны к штамму-антагонисту. Авторы указывают, что изученный ими штамм B. subtilis эффективно подавлял лишь 36,8% штаммов патогенных бактерий, среди которых были E. coli, Klebsiella spp., Ser-ratia spp. и др., тогда как изученные в нашей работе штаммы бактерий-антагонистов B. subtilis, B. amyloliquefaciens и B. licheniformis в 100% случаев ингибировали перечисленных патогенов. Продемонстрировано наличие у B. subtilis ингибирующей активности по отношению к таким фитопатогенным грибам, как A. alternata, B. cinerea, B. sorokiniana, Cladosporium sp., F. avenacium, F. oxysporum и др. [31]. При этом отмечено, что некоторые из изученных авторами штаммов обладали 100%-ной ингибирующей активностью в отношении B. cinerea и F. oxyspo-rum, чего не наблюдалось в наших экспериментах. Наблюдающиеся различия в оценке антагонистической активности бактериальных штаммов, представленные в разных работах, могут быть связаны с разным географическим происхождением изучаемых культур [32]. Различия в антагонистической активности против штаммов патогенов одного вида можно объяснить вариабельным составом пептидогликана бактериальной клетки, который является регулятором взаимоотношений в системе «прокариот - прокариот», а также регулятором внутриродового и межродового антагонизма в условиях межмикробных взаимодействий [33]. Заключение Таким образом, в результате проведенных исследований был выявлен антагонистический потенциал природных сибирских штаммов бактерий рода Bacillus. Бсе изученные штаммы бактерий-антагонистов B. subtilis, B. amyloliquefaciens и B. licheniformis проявили бактерицидное и фунгистатическое действия in vitro на чистых культурах патогенных бактерий и фитопатоген-ных грибов. Подавление штаммами-антагонистами роста патогенов, вызывающих болезни сельскохозяйственных животных и растений, перспективно для создания биопрепаратов, обеспечивающих получение экологически безопасной продукции животноводства и растениеводства, что важно для решения проблем здорового питания населения.

Скачать электронную версию публикации