The interposition of attachment points of XL and 3R chromosomes on the nuclear envelope in the cells of somatic and gene.pdf Введение Многочисленные исследования подтверждают, что каждая хромосома в пространстве ядра занимает определенное пространство, называемое хромосомной территорией [1-4]. В последнее десятилетие пространственная организация хромосом утвердилась в качестве важного фактора регуляции генов и стабильности генетического аппарата в целом [5, 6]. Неслучайная позиция хромосом в ядре обеспечивается прикреплением хромосом к каркасной структуре, роль которой выполняет ядерная ламина [7]. Было показано, что в геноме существуют домены, ассоциированные с ламином, которые могут быть как консервативными для всех тканей организма, так и ткане-специфичными [8]. Это предполагает участие районов прикрепления хромосом в направлении клеточной дифференцировки. Образование контактов в тех или иных участках хромосом может вызывать активацию или репрессию определенных паттернов генов, специфичных для каждой клеточной линии. Мы предположили, что в этом процессе может быть значимым не только наличие или отсутствие контактов хромосом с оболочкой в тех или иных районах, но и положение этих контактов хромосом друг относительно друга на ядерной оболочке. Для проверки гипотезы было необходимо оценить взаиморасположение точек контактов хромосом в пространстве ядра в клетках разных типов. Известно, что у малярийных комаров в трофоцитах политенные хромосомы образуют мощные контакты с ядерной оболочкой, которые можно наблюдать на полудавленных ядрах [9]. Важно, что система этих контактов в трофоцитах является видоспецифичной. В настоящем исследовании нами была проведена оценка взаимного расположения районов прикрепления XL и 3R хромосом на ядерной оболочке у малярийного комара Anopheles messeae Fall. В ходе сравнительного анализа мы ожидали выявления различий, которые свидетельствовали бы о значении колокализа-ции точек прикрепления хромосом клеток разных тканей в процессах функционирования, дифференцировки и развития клеток определенного типа. Для эксперимента были отобраны клетки, которые различаются уровнем плоидности (полиплоидные и диплоидные клетки), типом политении (классические политенные и со скрытой политенией), направлением дифферен-цировки (клетки зародышевого пути и соматические клетки), потенциями к дальнейшему развитию (терминально дифференцированные и стволовые). Нами были использованы следующие клеточные системы: 1) трофоциты яичников (терминально дифференцированные клетки зародышевого пути с политенными хромосомами классического типа); 2) клетки слюнных желез личинок (терминально дифференцированные клетки соматической системы с классическими политенными хромосомами); 3) клетки фолликулярного эпителия (терминально дифференцированные клетки соматической системы со скрытой политенией); клетки имагинальных дисков (плюрипотент-ные клетки соматической системы с диплоидным набором хромосом). материалы и методики исследования Для обнаружения в интактном клеточном ядре интересующих районов нами была использована методика флуоресцентной in situ гибридизации ДНК с интактными клеточными ядрами (3D FISH). Эта методика позволяет определить пространственное расположение любой ДНК в ядре. ДНК-пробы районов прикрепления хромосом XL и 3R An. messeae были получены нами ранее в результате микродиссекции районов 32d и 2b-c [10]. Для того чтобы иметь возможность одновременно в одном ядре наблюдать два хромосомных района, с помощью ПЦР в ДНК-пробу района 2b-c XL хромосомы включали модифицированный нуклеотид TAMRA-5'-дУТФ, а в 32d района 3R хромосомы - биотин-11-дУТФ с помощью ПЦР с частично вырожденным праймером MW6 [11]. КМ А ж*- д г\ Б # i * Рис. 1. Результат 3D FISH ДНК районов прикрепления XL (красный сигнал) и 3R (зеленый сигнал) с ядрами трофоцитов (А), клеток слюнных желез (Б), клеток фолликулярного эпителия (В) и клеток имагинальных дисков (Г): на рис. Б представлена трехмерная реконструкция ядра, хроматин окрашен DAPI, масштабная линейка 5 мкм Анализ взаиморасположения районов прикрепления хромосом проводился в трофоцитах яичников имаго, клетках слюнных желез личинок, клетках фолликулярного эпителия имаго и клетках имагинальных дисков личинок малярийного комара An. messeae. Для этого в растворе Карнуа (96% этанол и ледяная уксусная кислота в объемных соотношениях 3:1) фиксировали яичники самок III стадии развития по Селла (для экспериментов с трофоцитами и клетками фолликулярного эпителия) и личинок IV возраста (для экспериментов с клетками слюнных желез и имагинальных дисков). При проведении флуоресцентной in situ гибридизации на интактных ядрах (3D FISH) тканей малярийного комара руководствовались протоколом, описанным подробно в литературе [11]. Таким образом, нами были получены препараты ядер трофоцитов яичников, клеток слюнных желез, клеток фолликулярного эпителия и клеток имагинальных дисков, в каждом из которых положение ДНК районов прикрепления хромосом XL и 3R определялось соответствующим флуоресцентным сигналом (рис. 1). (Xxl*X3r+Y3r+Zxl*ZJ а = arcoss- ((Х^+^^ИХз2^2^)) б Рис. 2. Схематическое изображение положения векторов в пространстве ядер трофоци-тов малярийного комара (а) и формула для расчета угла, образованного этими векторами с известными координатами (б). Стрелки - векторы, проведенные из центра ядра (Ц) в районы прикрепления хромосом (XL, 3R1 и 3R2), в формуле X, Y, Z - координаты векторов, проведенных к точкам прикрепления XL и 3R хромосом, обозначенных соответствующими индексами. Координатами точки прикрепления 3R хромосомы к ядерной оболочке принимали средние значения по координатам каждого гомолога (точки 3R1 и 3R2) Приготовленные препараты интактных ядер микроскопировали с помощью микроскопа Axio Imager Z1 («Carl Zeiss», Германия), а клетки имаги-нальных дисков - с помощью конфокального микроскопа LSM 780 («Carl Zeiss», Германия). Анализ, получение и обработку фотографий, а также создание ЭБ-моделей ядер проводили с помощью программы AxioVision 4.7 «Carl Zeiss» (Германия). После получения серии фотографий оптических срезов ядра в режиме «CutView» программы AxioVision 4.7 были определены пространственные координаты следующих точек (рис. 2): 1) периферическая область сигнала, соответствующая району прикрепления XL хромосомы; 2) периферическая область сигнала, соответствующая району прикрепления 3R хромосомы (или двух сигналов для каждого гомолога); 3) центр ядра (определялся по сигналу DAPI в трех проекциях). Довольно часто в районе прикрепления 3R хромосомы к ядерной оболочке трофоцитов мы наблюдали два сигнала из-за расхождения гомологов в этом районе. Поэтому координатами точки прикрепления этой хромосомы к ядерной оболочке принимали средние значения по координатам каждого гомолога. Для оценки расстояния между точками контактов районов прикрепления хромосом XL и 3R к ядерной оболочке мы вычисляли угол, который образовывали воображаемые векторы ^XL и в3R), проведенные из центра ядра к периферическим областям сигналов соответствующих районов хромосом, по формуле, приведенной на рис. 2. Такой критерий оценки, на наш взгляд, является наиболее подходящим, так как он не зависит от размеров ядер и позволяет анализировать ядра со сложной формой. Таким образом, нами был получен массив данных по значениям углов между такими векторами для клеток каждой ткани. Значения углов в градусах являлись мерой удаленности двух точек на ядерной оболочке. Так, для значения угла 0° точки прикрепления хромосом совпадают, а для значения 180° находятся на противоположных полюсах ядра. Количество проанализированных ядер составляло: для трофоцитов яичников - 320 (5 особей), для клеток слюнных желез - 100 (10 особей), для клеток фолликулярного эпителия - 75 (5 особей), для клеток имагинальных дисков - 80 (12 особей). Значения углов были разбиты на три класса со значениями угла 0-60°, 60-120° и 120-180°. Нами не было обнаружено ни одного угла со значениями 60° и 120°, что не затруднило группировку данных. Статистическая обработка полученных данных и построение графиков выполнены в программе StatSoft STATISTICA 6.0. Результаты исследования и обсуждение В результате проведенной нами флуоресцентной in situ гибридизации было показано, что ДНК пробы, соответствующие районам прикрепления хромосом к ядерной оболочке трофоцитов, локализовались на периферии клеточных ядер во всех исследуемых органах комара. Это является косвенным свидетельством того, что изучаемые нами районы XL и 3R хромосомы выполняют функцию прикрепления к ядерной оболочке в каждой ткани организма и являются консервативными. Величина угла, образованного векторами вXL и вЭИ, которая в нашем эксперименте являлась критерием удаленности точек прикрепления хромосом на ядерной оболочке, варьировала в пределах от 6,6 до 174,6° в трофоцитах, от 28,3° до 159,5° в клетках слюнных желез, от 1,3 до 171,7° в фолликулярном эпителии и от 5,2° до 167° в имагинальных дисках. Диапазон варьирования углов в клетках слюнных желез несколько ниже, чем в других клетках - 131,2°, тогда как в трофоцитах этот диапазон 168°, в клетках фолликулярного эпителия - 170,4° и в клетках имагинальных дисков - 161,8°. Известно, что в клетках слюнных желез малярийных комаров хромосомы объединены друг с другом прицентромерными районами и образуют хромоцентр [12]. Очевидно, что образование хромоцентра влияет на взаимное расположение 3R и XL хромосом, которые связаны в прицентромерных районах, и препятствует как сближению, так и удалению точек контактов хромосом с ядерной оболочкой друг относительно друга. Следствием этого является меньший диапазон значений углов по сравнению с трофоцитами, хромосомы которых хро-моцентр не образуют, а также с клетками фолликулярного эпителия и имаги-нальных дисков, для которых нет данных по наличию хромоцентра. Анализ частот распределения значения углов для векторов вXL и в3R представлен на рис. 3. Рис. 3. Распределение частот ядер трофоцитов (А), клеток слюнных желез (Б), клеток фолликулярного эпителия (В) и клеток имагинальных дисков (Г) с различным взаиморасположением районов прикрепления XL и 3R хромосом: различия во взаиморасположении районов прикрепления хромосом к ядерной оболочке характеризуются углом между векторами вXL и в3R (см. объяснение в тексте) Распределения частот на диаграммах показывают, что клетки всех анализируемых тканей имеют особенности во взаиморасположении точек прикрепления хромосом на ядерной оболочке, что подтверждает сравнение выборок с помощью критерия Манна-Уитни. В клетках разных тканей мы наблюдали как общие особенности, так и яркие различия. В трофоцитах яичников и клетках слюнных желез, т.е. в клетках с классическими политенными хромосомами, с частотой около 50% преобладают ядра со значением углов между векторами 60-120°, однако крайние значения углов соответствующие сближенному (0-60°) и удаленному (120-180°) расположению, встречались с разной частотой в этих тканях. Так, в трофоцитах преобладали ядра с удаленным взаиморасположением точек прикрепления хромосом (31,82%), тогда как в слюнных железах такие ядра были представлены с частотой 4,3%. Следует отметить примечательную закономерность, связанную с отличием трофоцитов - клеток зародышевого пути - от клеток соматической системы. Только в трофоцитах мы наблюдали высокую частоту ядер с удаленным расположением точек прикрепления хромосом и относительно низкую частоту ядер со сближенным расположением таких точек. Клетки соматической системы - слюнных желез, фолликулярного эпителия и имагинальных дисков - в общем проявляли сходство в преобладании ядер со сближенным и промежуточным (60-120°) распределением точек прикрепления хромосом друг относительно друга. Пожалуй, наиболее схожим является распределение клеток слюнных желез и фолликулярного эпителия, так как в обеих клеточных системах частота ядер с удаленным взаиморасположением точек прикрепления хромосом составляла около 5%. Эти клетки являются специализированными дифференцированными клетками с политенными хромосомами. Очевидно, что тип политении (у клеток фолликулярного эпителия скрытая политения, а у клеток слюнных желез классические политенные хромосомы) не влияет на пространственную структуру взаимных отношений XL и 3R хромосом у An. messeae. Следует отметить, что в недифференцированных активно делящихся клетках имагинальных дисков мы наблюдали более высокую частоту ядер с удаленным расположением точек крепления хромосом к ядерной оболочке. Клетки имагинальных дисков несколько отличаются от остальных клеток соматической системы, так как частота ядер с удаленным расположением точек прикрепления у них выше и составляет около 20%. В этом отношении клетки имагинальных дисков более сходны с трофоцитами, чем с клетками слюнных желез и фолликулярного эпителия. Заключение Полученные нами данные показали, что система пространственной организации точек крепления хромосом на ядерной оболочке имеет ткане-специфичные особенности. Взаиморасположение этих точек, по-видимому, несет вероятностный характер, так как во всех клеточных системах нами был определен целый спектр значений удаленности районов прикрепления XL и 3R хромосом. Несмотря на это, статистический анализ частот распределения ядер со сближенным, промежуточным и удаленным расположением точек контактов показал, что разные типы взимоположения хромосом встречаются с определенной частотой в разных типах тканей. Интерпретация результатов обнаруженных межтканевых различий в настоящее время затруднена. Данные по более низкому диапазону вариаций расстояний между точками крепления XL и 3R хромосом в клетках слюнных желез по сравнению с остальными клетками можно объяснить присутствием в этих клетках хромоцентра. Возможно, что хромоцентр является основной причиной преобладания ядер со сближенным и промежуточным взаиморасположением точек прикрепления хромосом в клетках соматической системы, так как известно, что в ядрах трофоцитов у малярийных комаров его нет. Информация о существовании хромоцентра в клетках имагинальных дисков и фолликулярного эпителия могла бы прояснить эту ситуацию. Основное заключение, которое можно сделать из данной работы, состоит в том, что наиболее существенные отличия в пространственном взаиморасположении районов прикрепления XL и 3R хромосом наблюдались нами в клетках зародышевого пути - трофоцитах. Таким образом, мы подтвердили особое значение архитектуры хромосом в генеративной системе малярийного комара. Большой интерес вызывает отличие пространственной организации хромосом клеток имагинальных дисков от других клеток соматической системы, что наводит на мысль о присутствии в ядрах этих клеток необычной системы прикрепления хромосом к ядерной оболочке. Пока остается неясным, связаны ли наблюдаемые нами особенности данных клеток с их активным делением или со способностью к дальнейшей дифференцировке. Следует принять во внимание, что настоящее исследование проведено только на двух хромосомах, с локализацией наиболее выраженных контактов с ядерной оболочкой. При исследовании взаиморасположения других точек крепления или точек крепления других хромосом результаты могут быть отличными от полученных в этой работе. Дальнейшие исследования будут направлены на выяснение причин межтканевых различий в ядерной архитектуре хромосом у малярийных комаров.

Скачать электронную версию публикации