Morphogenesis of Norway spruce and Scots pine seedlings assimilating organs under the influence of red and blue LED ligh.pdf Введение Свет не только является источником энергии для фотосинтеза растений, но и оказывает комплексное действие на их морфогенез, начиная с прорастания семян и заканчивая плодоношением, листопадом и старением. Растения способны распознавать интенсивность светового потока, его продолжитель ность, спектральный состав и плоскость поляризации [1]. Световое излучение может оказывать как позитивное (увеличение скорости роста, образование хлоропластов), так и повреждающее действие (образование активных форм кислорода, разрушение ДНК). Непостоянность условий освещения в течение онтогенеза растения сделало необходимым формирование у него сложной фоторегуляторной сети, позволяющей сохранять высокие темпы ассимиляции при различном качестве света и минимизировать его повреждающее действие. Определенные участки спектра света играют особую роль в жизни растений. К ним относятся синий, красный и дальний красный диапазоны. Включение и / или исключение одного или нескольких из них приводит к значительному изменению процессов роста и развития растений. Ранее рядом исследователей изучалось влияние длинноволновых красных [2], коротковолновых синих [3] и зеленых [4] видов света на водоросли и цветковые растения. Была показана важная ассимиляционная и регуляторная роль света [5] в изменении активности белков мембран хлоропластов и дифференциальной экспрессии связанных с этими процессами генов фоторецепции и гормонального сигналинга [6]. Однако анализ научной литературы свидетельствует о наличии различных экспериментальных данных о последствиях воздействия сходного по качеству света на развитие видов растений, даже внутри одного семейства [7]. В экспериментах с красным и синим светом были зафиксированы значительные морфофизиологические и биохимические эффекты воздействия света на растения. Действие синего света приводило к снижению сухой биомассы, содержания хлорофиллов, но к увеличению содержания нуклеиновых кислот [8]. Синий свет вызывал миниатюризацию листьев с одновременным увеличением числа устьиц и уменьшением их среднего размера [9]. При действии красного света черешки листьев вытягивались, число устьиц снижалось, а клетки изменяли свою форму, становились более округлыми [10]. В клетках этих растений изменялся размер вакуолей, а также локализация и размер хлоропластов [11], при этом сухая масса растений на красном узкополосном свету была больше, чем у контрольных растений, выросших под белым люминесцентным светом [12]. Синий и красный виды света, сильно различающиеся по энергии излучения, воспринимаются двумя разными светочувствительными системами, которые имеют разные сигнальные пути. К таким сигнальным системам относятся фоторецепторы: фитохромы, адсорбирующие красный свет, крип-тохромы и фототропины, чувствительные к синей области спектра. Исследования светозависимых процессов позволили предположить существование нескольких различных типов ответных реакций растений на воздействие красного света: VLFRs (very low fluence responses, ответная реакция в пределах 0,1-1 ^E/м^с-1 света), LFRs (low fluence responses, ответная реакция в пределах 1-1 000 ^E/м^с-1) и HIRs (high-irradiance responses, ответная реакция от 1000 ^E/м^с-1) [13]. Наиболее распространенными физиологическими эффектами LFRs растений, которые стимулируются красным светом, являются прорастание семян, элонгации стебля, листьев и перехода к цветению [13]. При изменении соотношения в пользу дальнего красного (ДК) света в зависимости от своей ответной реакции LFRs растения подразделяются на две подгруппы: первая подгруппа отличается короткоднев-ной ответной реакцией на воздействие ДК света (наблюдается цветение), а у второй подгруппы наблюдается синдром избегания тени, который является приспособительным механизмом для определения каких-либо находящихся вблизи предметов или соседних растений. Таким образом, убедительные доказательства регуляторной роли красного и синего света для растений указывают на наличие значительных возможностей управления их ростом и развитием через качество получаемого света. Поэтому исследование перспектив использования узкополосного света в научном и практическом растениеводстве представляется авторам важной задачей биофизики и физиологии растений. Для изучения фотоморфогенеза растений при действии света различного спектрального состава, а также механизмов восприятия и передачи световых сигналов используются различные опытные системы, основанные на выделении нужного спектра света широкополосных светоизлучающих приборов (различные виды ламп) или на применении узкополосных источников света (светодиоды и лазеры). Развитие полупроводниковых технологий привело к созданию новых узкополосных источников света - сверхъярких светодиодов с пиками излучения в строго определенных областях спектра [14]. Несмотря на значительный прогресс в области изучения влияния красного и синего света на цветковые травянистые растения, на сегодняшний день недостаточно полно изучены реакции на данные виды света древесных и, тем более, хвойных растений. Литературные данные свидетельствуют об участии фитохромов в реакции на свет и темноту проростков сосны, влиянии на морфологию растений и активность важнейших ферментов, а также о фотопериодической регуляции покоя терминальных почек и длины хвои [15-17]. Популяции хвойных растений имеют широкий ареал обитания и, как следствие, способны адаптироваться к освещению со значительными качественными и количественными различиями [18, 19]. В отличие от покрытосеменных растений, хвойные способны к синтезу хлорофилла и экспрессии генов фотосинтеза в темноте [20]. Известно также, что фитохромы хвойных растений представлены другими, отличными от покрытосеменных минорными формами (фитохром N, фитохром O, фитохром P) [21]. Среди хвойных представлены растения, различающиеся по требовательности к свету, например, сосна обыкновенная - светолюбивый обитатель открытых пространств (гелиофит), а ель европейская - теневыносливый вид (факультативный гелиофит), предпочитающий полог леса на начальных этапах онтогенеза. Поэтому, несмотря на недостаточную изученность фоторегуляции у хвойных растений, можно утверждать, что они не только обладают большим разнообразием реакций на красный и синий свет в сравнении с цветковыми растениями, но и, возможно, имеют дополнительные пути светового сингалинга. В связи с этим целью настоящей работы стало исследование особенностей роста и развития ассимилирующих органов: семядолей и хвои 6-недельных сеянцев сосны обыкновенной и ели европейской, выращенных в условиях освещения узкополосным монохроматическим светом. материалы и методики исследования Семена сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и ели европейской (Picea abies (L.) H. Karst.) сбора 2010 г. предоставлены Учебно-опытным лесхозом Брянской государственной инженерно-технологической академии. Проращивание семян проводили в климатической камере при 16-часовом световом периоде в условиях водной культуры [22, 23]. Опытные варианты сразу после посева помещали в камеры с освещением от светодиодных матриц мощностью 50 Вт из арсенида-фосфида галлия и нитрида индия-галлия, излучающих свет в красной (660 нм) и синей (465 нм) областях спектра и выровненных по количеству падающих квантов (150 ± 30 цБ/м^с-1). В качестве контроля использовали вариант, освещаемый полихроматическим белым светом от люминесцентных ламп холодного дневного света OSRAM L36W/765 (150 ± 30 ^E^x-1). С момента сброса семенной кожуры и развертывания семядолей сеянцы выращивали на специально разработанной питательной среде [22, 23]. Эксперимент заканчивали по достижении сеянцами возраста 6 недель. Оценку темпов накопления биомассы сеянцами проводили гравиметрическим методом. Измерения средних длин семядолей и хвои (с точностью 0,01 мм), а также подсчёт их количества проводили по отсканированным изображениям растений в программе MapInfo Professional v.9.5. Для определения содержания хлорофиллов a и b и каротиноидов образцы семядолей и хвои высушивали при 60°С до постоянной массы и гомогенизировали в фарфоровой ступке с кварцевым песком и холодным 80% ацетоном. Оптическую плотность экстрактов измеряли при длинах волн 470, 646 и 663 нм на спектрофотометре «Genesys 10UV» («Thermo Electron Corporation», США). Расчёт содержания хлорофиллов a, b и каротиноидов проводили по формулам, предложенным Лихтенталером [24], и выражали в мг/г сухой массы. Для анализа качественного состава пигментов методом тонкослойной хроматографии получали экстракты пигментов свежих листьев растений (200 мг) в смеси этанол : ацетон : диэтиловый эфир (1:1:1). Пигменты экстракта разделяли на хроматографических пластинах из силикагеля 60 на алюминии («Merck», Англия) в затемненной камере смесью ацетон : гек-сан : петролейный эфир (1:1:1 по объему). Для идентификации разделенных пигментов пятна элюировали этанолом и измеряли спектры поглощения полученных растворов на спектрофотометре «Nanodrop 2000» («Thermo Fisher scientific», США). Анатомическое строение хвои изучали под микроскопом «Imager D1» («Carl Zeiss», Германия) с цифровой фотонасадкой на временных препаратах поперечных срезов, полученных с помощью микротома с вибрирующим лезвием HM650V («Thermo Fisher Scientific», США). Эксперименты проводили в трёх независимых сериях. Количество наблюдений составляло 30-45 при определении морфометрических параметров и 5-22 при анализе содержания фотосинтетических пигментов. Сильно отклоняющиеся варианты выборок исключали из анализа на основании критических значений разности между крайними вариантами совокупности на уровне значимости 0,05. Данные обрабатывали методами параметрической статистики в среде Microsoft Excel 2010. Итоговые значения, приводимые в тексте, представляют собой среднюю арифметическую величину ± основную ошибку средней арифметической величины. Результаты исследования и обсуждение Полученные результаты показали существенное различие в развитии как между видами исследуемых растений, так и между опытными вариантами для одного вида. Общая масса сеянцев сосны, масса ее хвои и семядолей в контрольных условиях была существенно выше, чем у сеянцев ели (в 2,2, 1,8 и 1,3 раза соответственно), что свидетельствовало о более высоких темпах развития сеянцев сосны. Похожее соотношение сохранялось у сеянцев, выращенных под красным светом. Биомасса сеянцев сосны и ели, выращенных под красным светодиодом, существенно не отличалась (p > 0,05) от соответствующих контрольных групп растений. Выращивание под синим светом приводило, с одной стороны, к снижению биомассы сеянцев обоих видов в сравнении с контролем, а с другой стороны - к еще большему усилению различий между видами (рис. 1). Значение биомассы органов растений является интегральным показателем, обобщающим результаты протекания многих процессов. Поэтому различия в массах ассимилирующих органов в разных условиях освещения могут свидетельствовать об изменении либо длины этих органов, либо их толщины, либо о сочетании двух этих процессов. У обоих видов растений красный свет вызывал увеличение длин семядолей и хвои в сравнении с контролем, причем наибольшее стимулирующее действие этого света наблюдалось по отношению к хвое ели (31,4% против 24,4% у сосны). С другой стороны, при действии красного света семядоли сеянцев сосны в сравнении с контролем удлинялись активнее, чем семядоли сеянцев ели (на 20,5% и на 6% соответственно, p < 0,01). Воздействие синего света не вызывало увеличения длин ассимилирующих органов сеянцев сосны, а у сеянцев ели Т а б л и ц а 1 Влияние красного и синего света на морфометрические параметры ассимилирующих органов сеянцев Сосна обыкновенная Ель европейская Лампы Синий Лампы Синий Параметр дневного Красный светодневного Красный светосвета (консветодиод диод света светодиод диод троль) Длина хвои, мм 36,2±0,4 45,0±1,4 36,4±1,0 17,2±0,8 22,6±0,6 15,4±0,6 Длина семядоли, мм 26,4±0,3 31,8±0,9 27,1±0,7 16,6±0,4 17,6±0,5 15,9±0,5 Количество 35,3±0,4 24,6±0,4 24,4±0,5 26,5±1,9 29,9±0,8 17,1±0,8 хвои, шт. Во всех опытных вариантах сеянцы сосны отличались от контрольной группы меньшим числом хвои - на 30-31% (p < 0,001). У ели, напротив, только освещение синим светом можно было считать ингибирующим, так как количество хвои было на 35,4% меньше (p < 0,001), чем в контроле, в то время как красный свет усиливал образование хвои на 12,8% (p < 0,01). Таким образом, действие красного света, явно стимулирующее удлинение хвои сеянцев сосны, ограничивалось только реакцией растущей хвои и не распространялось на апикальную меристему побега, которая обеспечивает заложение новых листовых примордиев. У ели воздействие красного света было более масштабным и не только стимулировало пластинчатую меристему хвои, ответственную за рост органа в длину, но и усиливало заложение большего числа листовых примордиев на верхушке побега, что приводило к заметному увеличению количества хвоинок. ингибировало их развитие, что приводило к формированию более коротких хвоинок и семядолей (на 10,5 и 4,2% соответственно). Рис. 1. Влияние красного и синего света на общую массу сеянцев (1), массу хвои (2) и массу семядолей (3) 1 2 3 Рис. 2. Микрофотографии поперечных срезов хвои 6-недельных сеянцев сосны, выращенных под светом от ламп дневного света (1), красного светодиода (2) и синего светодиода (3). Буквами обозначены: К - ксилема, Сх - смоляной ход, Схл - складчатая хлоренхима, Ф - флоэма, Э - эпидерма, Эд - эндодерма Наблюдаемые эффекты воздействия света различного спектрального состава на морфологические параметры исследуемых растений должны иметь свое отражение на мезоструктуре ассимилирующих органов. Анатомическое строение хвои сеянцев сосны, выращенных под синим светом, не имело существенных отличий от контрольных вариантов (рис. 2), в то время как воздействие красного света приводило к развитию более крупной хвои, имеющей большую толщину мезофилла и больший диаметр проводящего пучка, чем у контрольных растений. На фоне наблюдаемого увеличения объемов тканей хвои сосны было отмечено одновременное увеличение среднего размера всех клеток, составляющих данные ткани. Таким образом, увеличение размеров хвои, отмеченное выше для сеянцев сосны, выращенных под красным светом, можно связывать со стимуляцией роста органа за счет растяжения клеток. 1 2 3 Рис. 3. Микрофотографии поперечных срезов хвои 6-недельных сеянцев ели, выращенных под светом от ламп дневного света (1), красного светодиода (2) и синего светодиода (3). Буквами обозначены: К - ксилема, Сх - смоляной ход, Ф - флоэма, Х - хлоренхима, Э - эпидерма, Эд - эндодерма Сходное действие красного света наблюдалось в анатомическом строении хвои ели, которое характеризовалось увеличением толщины мезофилла на абаксиальной и адаксиальной сторонах. Однако, в отличие от сосны, мезофилл боковых поверхностей хвои сеянцев ели не утолщался, и поэтому поперечный срез хвои терял исходную форму и приобретал характерные выпуклости на утолщенных сторонах (рис. 3). На фоне заметного увеличения объемов ассимилирующей ткани не отмечалось существенного укрупнения размеров клеток. Воздействие синего света на анатомическое строение хвои ели проявлялось в значительном сокращении диаметра данного органа и уменьшении объемов как ассимилирующей ткани, так и проводящего пучка. В этих условиях клетки фотосинтезирующей паренхимы были мельче и малочисленней, чем у контрольных растений, но форма хвоинки при этом не изменялась. Полученные результаты показывают, что независимо от экологической принадлежности сосны к гелиофитам, а ели к факультативным гелиофитам красный свет обладал сходным воздействием на анатомию их ассимилирующих органов и стимулировал утолщение фотосинтезирующей ткани. Наблюдаемый эффект красного света отличает исследуемые хвойные растения от цветковых. Так, у молодых растений огурца, подсолнечника и редиса отмечалось уменьшение толщины листа и объема палисадной хлоренхимы при освещении красным светом [25]. В отличие от действия красного света, действие синего света вызывало различную реакцию хвои сеянцев сосны и ели. Как отмечалось выше, влияние синего света на рост и деление клеток хвои ели носило инги-бирующий характер, что становилось причиной снижения массы хвои на 50%. Воздействие света различного спектрального состава не только имеет большое значение для морфогенеза, как это было продемонстрировано выше, но и служит важным сигналом для адаптации фотосинтетического аппарата растения [26]. Это должно способствовать повышению эффективности фотосинтеза при поглощении хлоропластами света различного спектра, а также снижению повреждающего действия излучений с высокой энергией. Для оценки изменений фотосинтетического аппарата исследуемых растений был проведен качественный и количественный анализ фотосинтетических пигментов в семядолях и хвое сеянцев сосны и ели. Полученные данные выявили сходную реакцию хвои сеянцев сосны и ели на освещение красным светом, что выражалось в существенном снижении содержания пигментов (табл. 2). Наибольшее снижение (при p < 0,001) было характерно для хлорофилла b (на 42%) и для каротиноидов (на 4953%). Вместе с этим, исследуемые растения различались по реакции на синий свет. В отличие от хвои сосны, в которой при действии синего света наблюдалось снижение содержания всех исследованных пигментов относительно контроля, в хвое ели в аналогичных условиях происходил значительный рост количества хлорофилла а (на 32%) и хлорофилла b (на 34%), а уровень каротиноидов был близок к контрольным значениям. Т а б л и ц а 2 Содержание фотосинтетических пигментов в хвое сеянцев сосны и ели при действии света различного спектрального состава Качественный анализ пигментов, проведенный методом тонкослойной хроматографии, выявил в хвое сеянцев сосны и ели несколько основных Параметр Сосна обыкновенная Ель европейская Лампы дневного света Красный светодиод Синий светодиод Лампы дневного света Красный светодиод Синий светодиод Содержание хлорофилла а, мг/г сухой массы 2,33±0,08 1,79±0,11 2,12±0,14 1,78±0,11 1,20±0,06 2,35±0,11 Содержание хлорофилла b, мг/г сухой массы 0,57±0,03 0,33±0,02 0,40±0,03 0,38±0,03 0,22±0,01 0,51±0,04 Содержание каротиноидов, мг/г сухой массы 0,45±0,02 0,23±0,005 0,28±0,02 0,43±0,04 0,20±0,002 0,42±0,006 Отношение содержания хлорофиллов а к b 4,32±0,13 5,43±0,08 5,36±0,08 4,68±0,12 5,51±0,11 4,90±0,17 Отношение содержания каротиноидов к сумме хлорофиллов а и b 0,15±0,002 0,12±0,005 0,11±0,004 0,19±0,008 0,15±0,007 0,14±0,005 На воздействие как синего, так и красного света семядоли сосны и ели реагировали снижением содержания всех изучаемых пигментов (данные не приведены). Вместе с этим содержание хлорофиллов а, b и каротиноидов в семядолях обоих растений было выше, чем в хвое. Рис. 4. Фрагмент хроматограммы фотосинтетических пигментов из хвои 6-недельных сеянцев сосны (1-3) и ели (4-6), выращенных под светом различного спектрального состава: 1, 4 - лампы дневного света; 2, 5 - красный светодиод, 3, 6 - синий светодиод. Римскими цифрами обозначены: I - Р-каротины, II - феофитин а, III - хлорофилл b, IV - хлорофилл а, V - хлорофилл b, VI - лютеин групп пигментов: хлорофилл а и феофитин а, хлорофилл b, Р-каротины, виолоксантин и лютеин (рис. 4). Полученные данные показали отсутствие заметных изменений в качественном составе фотосинтетических пигментов хвои сосны и ели при воздействии красного или синего видов света. Вместе с этим хроматография подтвердила уже обнаруженную тенденцию к снижению содержания пигментов в хвое при выращивании сеянцев сосны или ели под красным светом. Отношение содержания хлорофилла a к хлорофиллу b в хвое обоих растений было высоким, особенно в опытных вариантах, и это отношение достигало максимума при воздействии красного света (табл. 2). Отношение содержания каротиноидов к сумме хлорофиллов в хвое исследуемых растений было максимальным в контрольных условиях и минимальным при действии синего света. Анализ отношения содержания хлорофиллов a к b и отношения содержания каротиноидов к сумме хлорофиллов позволяет диагностировать оптимальность интенсивности используемого освещения [23]. В работах Бер-тамини было показано, что отношение каротиноидов к хлорофиллам повышается, а отношение хлорофилла а к хлорофиллу b снижается в хвое ели в условиях недостаточного освещения [27]. В наших экспериментах у сосны и ели отношение содержания хлорофиллов а и b повышалось в опытных условиях, а отношение каротиноидов к сумме хлорофиллов немного снижалось, следовательно, интенсивность освещения исследуемых растений была близка к оптимальному уровню. Заключение Анализ полученных данных показывает, что красный свет оказывает в целом сходное воздействие на растения сосны и ели. Сеянцы исследуемых видов, выращенные под красным светом, при сопоставимой массе отличались от контрольных растений более крупными хвоинками и семядолями и пониженным содержанием основных фотосинтетических пигментов. Поскольку красный свет является преобладающим в спектре действия фотосинтеза и эффективно поглощается хлорофиллом [28], выращивание растений под красным светом должно повышать продуктивность их фотосинтеза и стимулировать запасание энергии и рост органов, что и наблюдалось в наших экспериментах. Следует отметить, что утолщение мезофилла хвоинок при действии красного света у изученных растений, по-видимому, происходит различными путями: у сосны пропорциональный рост хвои в диаметре обеспечивается за счет увеличения размера клеток, а для ели свойственно двухстороннее утолщение за счет увеличения количества самих клеток мезофилла. Снижение содержания фотосинтетических пигментов у обоих видов растений в пределах 40-50%, опосредованное действием красного света, может определяться меньшей потребностью в реакционных центрах фотосистем в условиях избытка поглощенной световой энергии. К видовым особенностям действия красного света следует отнести очевидное различие в реакции верхушек побегов сосны и ели, заключающееся в стимуляции или ингибировании образования новых хвоинок. Вероятно, обнаруженные различия сигнальных свойств красного света для изученных растений связаны с особенностями местообитания подроста сосны и ели. Подрост сосны предпочитает открытые пространства, обеспечивающие свет с полным спектром, в то время как молодые ельники формируются преимущественно под пологом леса, где свет обогащен красным и дальним красным участками спектра. Действие синего света обнаруживало больше различий между изученными видами. Ассимилирующие органы сеянцев сосны, выращенные на синем свету, не имели сильных отличий от растений, освещавшихся «белым» полихроматическим светом люминесцентных ламп. Рост и развитие ели, напротив, значительно ингибировались под синим светом: растения имели наименьшую массу органов, тонкую хвою с высоким содержанием хлорофилла. Несмотря на то что синий свет обладает максимальной энергией, усвояемой растениями, он имеет большое значение для них не столько как субстрат, сколько как важный сигнальный фактор, вовлеченный во множество физиологических и онтогенетических процессов. Условия выращивания, в которых растения ели получали исключительно синий свет, по-видимому, настолько сильно отличались от условий естественной среды, где этот участок спектра значительно подавлен, что сеянцы были неспособны к требуемой адаптации и существенно отставали в развитии от контрольных растений. Не следует исключать, что на более поздних этапах онтогенеза изученные растения будут иначе реагировать на воздействие красного и синего света, поскольку для реализации определенных этапов жизненного цикла (например, при формировании репродуктивных органов, эмбриогенезе и др.), возможно, будет благоприятно освещение другого спектрального состава, в том числе с высоким уровнем синего света.

Скачать электронную версию публикации