The influence of immobilization on indices of stress reaction in rats and dogs.pdf Введение Проблема стресса на сегодняшний день сохраняет высокую медико-социальную значимость [1-3]. Напряжение является ведущей причиной многих заболеваний. Стресс - это комплекс общих универсальных неспецифических реакций на агенты, угрожающие жизни и благополучию целостного организма, реализуемый при обязательном участии нейроэндокринной системы [4]. Система обеспечения стрессорных реакций включает в себя центральное звено, к которому относятся нейроны паравентрикулярного ядра гипоталамуса, продуцирующие кортикотропин-рилизинг-гормон и аргинин - вазопрессин, катехоламинергические нейроны и другие нейроны, локализующиеся в стволе мозга. Периферическая часть представлена гипо-таламо-гипофизарно-надпочечниковой осью и симпатико-адреналовой си стемой. Хорошо известно, что при адаптационных изменениях в ответ на воздействие различных стрессоров происходят также значительные сдвиги в функциональном состоянии парасимпатической нервной системы [5, 6]. Перестройка нейрогуморальных регуляторных систем происходит в зависимости от природы и длительности действия стрессирующих факторов [7], возрастных, видовых и индивидуальных особенностей организма [810]. Существует мнение, что у животных, имеющих разную поведенческую стратегию, адреналовая система реагирует на стрессорное воздействие по-разному [11]. Выдвинута гипотеза о том, что трем моделям поведения организмов при стресс-реакции («битва», «бегство» и «мнимая смерть») соответствуют три физиологических механизма реагирования (норадренер-гический, адренергический и серотонинергический) [12]. Кроме того, известно, что адаптационные реакции разного типа, сроки развития стадий и напряженность определяются силой и качеством раздражителей [13, 14]. Некоторые из принципиальных вопросов нейроэндокринной регуляции стресса могут быть решены только в опытах на животных. В эксперименте всегда присутствуют определенные раздражители (инъекции), сопряженные с выполнением самой экспериментальной работы (например, одновременно или последовательно включающиеся в действие раздражители, специфические только для данной экспериментальной модели). В связи с тем, что такие раздражители не изменяют базальный уровень определяемых показателей, их, как правило, считают подпороговыми и несущественными. Однако подпороговые стимулы определенного качества могут стать весомым фактором, модулирующим нейроэндокринную реакцию организма при стрессе. Их наличие в эксперименте нельзя недооценивать, и необходимо четко определять их роль. Зная вклад подобных раздражителей, их можно целенаправленно применять для управления эндокринной реакцией при стрессе и получать адаптационные реакции разного типа с характерным комплексом изменений изучаемых показателей, различные сроки развития стадий и различную напряженность; использовать в создании моделей для исследования фармакологических веществ, модулирующих действие стресса и не только. Цель исследования - изучение влияния различного временного сочетания дополнительных стресс-воздействий после иммобилизации на количество лейкоцитов, лейкограмму и уровень кортикостероидов в плазме у крыс и собак. Материалы и методики исследования Эксперименты выполнены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. Опыты проведены на 30 крысах-самцах, линии Вистар, массой 180-240 г, и 7 беспородных собаках-самцах, весом 15-22 кг, с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского Сообщества (86/609/EC) [15]. В данной работе мы моделировали различные ответные реакции организма, используя маркеры скрытых функциональных резервов организма. В качестве маркеров выступили иммобилизация, карбахолин и физиологический раствор. Инъекции физиологического раствора нередко используются в качестве контроля к парентеральному введению каких-либо фармакологических агентов, что является стрессирующим фактором для экспериментальных животных [16]. Иммобилизацию крыс однократно в течение 18 часов [17] осуществляли фиксацией животного на спине за все конечности на операционном столике; иммобилизацию собак - помещением животных в узкие клетки из деревянных реек. Неизбирательный холиномиметик карбахолин («Reanal», Венгрия) вводили внутримышечно крысам в дозе 25 мкг/кг, собакам - 6 мкг/кг. Физиологический раствор крысам вводили внутрибрюшинно в объеме 1 мл на 200 г массы, собакам - внутривенно в объеме 1 мл на 10 кг массы тела. В рамках данной работы были выполнены следующие серии: 1) крысам вводили физиологический раствор одновременно с карбахолином; 2) крысам вводили физиологический раствор и через 30 мин - карбахолин; 3) собакам вводили физиологический раствор одновременно с карбахолином; 4) сразу после иммобилизации крысам вводили физиологический раствор одновременно с карбахолином; 5) сразу после иммобилизации крысам вводили физиологический раствор и через 30 мин - карбахолин; 6) через 30 мин после иммобилизации собакам вводили физиологический раствор одновременно с введением карбахолина. Кровь для лабораторных исследований отбирали у крыс из артерии во время декапитации (через 45 и 75 мин после введения физиологического раствора), у собак - из подкожной вены голени (через 150 мин после введения физиологического раствора). Интенсивность стресс-реакции определяли с помощью таких критериев, как изменение уровня 11-оксикортикостеро-идов (11-ОКС) в плазме крови, а также изменение содержания общего числа лейкоцитов и их отдельных морфологических форм в периферической крови у собак и крыс [18]. Флуориметрический метод определения 11-ОКС в плазме крови (Ю.А. Панков, И.Я. Усватова [19]) позволял судить о содержании в плазме крови собак суммарного количества двух основных гормонов, секретируемых корой надпочечников, - кортизола и кортикостерона, а в плазме крови крыс - кортикостеро-на. Метод основан на способности кортикостероидов, имеющих гидроксилы в 11 и 21 положениях и 3-кетогруппу в кольце А, обнаруживать флуоресценцию после обработки проб смесью концентрированной серной кислоты и этилового спирта. Для проведения анализа требовался 1 мл плазмы крови. В пробирку, промытую гепарином, собирали 2,5-5 мл крови из подкожной вены голени у собак и из артерии во время декапитации у крыс. Подсчёт лейкограммы производили на 500 клеток с использованием микроскопа МБИ ЗУ42 «Ломо» после окраски мазка по Романовскому. Подсчёт лейкоцитов производили в счётной камере Горяева с использованием микроскопа МБИ ЗУ42 «Ломо». Диапазон варьирования процентного содержания морфологических форм лейкоцитов и концентрации 11-ОКС в плазме крови оставался в пределах физиологических колебаний у всех групп экспериментальных животных [15, 20]. Статистический анализ данных проводился с помощью прикладного пакета StatSoft STATISTICA 6.0. Вычислялись среднее значение анализируемого показателя (M), стандартная ошибка среднего (m) и критерий значимости, относительно которого определялся достигаемый уровень значимости (p). Статистический анализ достоверности различий между выборками проводили с использованием непараметрического критерия Mann - Whitney (U test) и критерия Стьюдента (t). Статистически значимыми считались различия при p < 0,05 [21]. Результаты исследования После введения крысам, претерпевшим иммобилизационный стресс (ИС), физиологического раствора одновременно с карбахолином зарегистрировали уменьшение на 60% концентрации кортикостерона в плазме крови. Введение физиологического раствора крысам после ИС за 30 мин до введения карбахолина привело к увеличению уровня кортикостерона в плазме крови на 60% (табл. 1). Т а б л и ц а 1 изменения концентрации кортикостерона, суммарного количества лейкоцитов и их морфологических форм у крыс после действия иммобилизации Показатели периферической крови Контроль - введение ФР и кар-бахолина, M±m (n = 14) Введение ФР одновременно с карбахолином после ИС, M±m (n = 8) Введение ФР за 30 мин до карбахо-лина после ИС, M±m (n = 7) Уровень кортикостерона, мкмоль/л 0,5±0,02 0,2±0,005* 0,8±0,10* Общее число лейкоцитов, х(109/л) 3,58±0,168 12,84±0,826* 8,69±0,835* Палочкоядерные нейтрофилы, % 2,4±0,52 1,0±0,51 1,0±0,01 С егментоядерные нейтрофилы, % 47,4±3,07 77,0±4,60* 75,0±2,89* Эозинофилы, % 0,1±0,10 0,0±0,0 0,5±0,29 Моноциты, % 3,0±0,36 3,8±0,31 1,0±0,0* Лимфоциты, % 46,4±2,98 17,4±4,06* 22,5±2,59* Базофилы, % 0,1±0,10 0,0±0,0 0,0±0,0 Примечания. Здесь и далее M±m - среднее ± стандартная ошибка среднего; n - объем выборки, соответствующий количеству опытов; ФР - физиологический раствор; ИС -иммобилизационный стресс; * - статистически значимые отличия от контроля (p < 0,05). Среди признаков, характеризующих стресс-реакцию у крыс, отмечены: выраженный нейтрофильный лейкоцитоз за счёт сегментоядерных нейтро-филов, моноцитопения и лимфопения. Суммарное количество лейкоцитов у крыс, подверженных иммобилизации, после введения физиологического раствора одновременно с карбахолином увеличивалось наиболее значительно (на 258%) в сравнении с введением физиологического раствора за 30 мин до холиномиметика стрессированным животным (увеличение на 143%) (табл. 1). Количество сегментоядерных нейтрофилов практически равноценно увеличивалось после введения физиологического раствора одновременно с карба-холином (на 62%) и за 30 мин до агониста холинорецепторов (на 58%) крысам, подверженным иммобилизации. Содержание лимфоцитов снижалось на 62% после введения физиологического раствора одновременно с карбахолином и на 51% - после введения раствора за 30 мин до холиномиметика. Следует отметить, что изменение количества моноцитов (уменьшение их числа на 67%) после ИС регистрировали лишь у крыс, которым вводили физиологический раствор за 30 мин до карбахолина. Содержание эозинофилов значимо не изменялось, но имело тенденцию к уменьшению в случае введения физиологического раствора одновременно с карбахолином стрессированным крысам, и тенденцию к увеличению - в случае введения физиологического раствора за 30 мин до холиномиметика крысам после иммобилизации. Есть мнение, что уменьшение числа эозинофилов наблюдают на фоне превалирования симпатической нервной системы после нагрузок - и увеличение клеток - при активации парасимпатической нервной системы после действия нагрузок [22]. У собак в контрольных опытах наблюдалась значительная вариабельность в соотношении морфологических форм лейкоцитов и концентрации 11-ОКС в плазме крови, что позволило разделить животных на две группы (табл. 2). Для собак первой группы характерно большое количество палоч-коядерных нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов, но малое содержание лимфоцитов и невысокая концентрация 11-ОКС в плазме крови. Во вторую группу включены животные с низким содержанием палочкоядерных ней-трофилов, эозинофилов, моноцитов и высоким - лимфоцитов. При этом концентрация 11-ОКС вдвое превышала соответствующий показатель у собак первой группы. Есть данные, что при доминировании парасимпатического отдела вегетативной нервной системы в периферической крови отмечается более высокое содержание лимфоцитов в сравнении с аналогичным показателем у симпатикотоников [23]. Существенные различия между группами собак отмечены по степени выраженности стрессорной реакции. Так, после иммобилизации у собак первой группы содержание 11-ОКС увеличилось на 300% (с 0,3±0,04 до 1,2±0,04 мкмоль/л, p < 0,05), а у животных второй группы - на 167% (с 0,6±0,08 до 1,6±0,08 мкмоль/л, p < 0,05). Суммарное количество лейкоцитов у собак обеих групп после иммобилизации увеличилось на 95% - с 10,06±0,577х(109/л) до 19,62±0,570х109/л (p < 0,05). Т а б л и ц а 2 Показатели периферической крови в контрольных опытах у собак Показатели Первая группа Вторая группа M±m (n = 23) M±m (n = 15) Концентрация 11-ОКС, мкмоль/л 0,3±0,04 0,6±0,08** Общее число лейкоцитов, х(109/л) 10,39±0,944 9,33±0,746 Лейкограмма, %: палочкоядерные нейтрофилы 12,0±0,99 2,0±0,22** сегментоядерные нейтрофилы 57,3±1,21 56,0±6,15 эозинофилы 2,2±0,16 0,8±0,40** моноциты 5,6±0,31 4,0±0,38** лимфоциты 22,3±0,60 37,3±6,49** базофилы 0,3±0,09 0±0** ** - статистически значимые отличия от первой группы (p < 0,05). Характерное для первой группы собак в контрольных опытах высокое содержание палочкоядерных нейтрофилов после воздействия стресса не изменилось. В то же время во второй группе животных стресс вызывал увеличение палочкоядерных нейтрофилов на 110% (табл. 3). Т а б л и ц а 3 Изменение морфологических форм лейкоцитов после действия иммобилизации у собак Гемограмма Группа собак Контроль - введение ФР и карбахолина, M±m (n1 = 23, n2 = 15) Введение ФР и карбахолина после ИС, M±m (n1 = 19, n2 = 15) Палочкоядерные нейтрофилы Первая 12,0±0,99 13,1±0,90 Вторая 2,0±0,22 4,2±0,68* Сегментоядерные нейтрофилы Первая 57,3±1,21 68,2±2,92* Вторая 56,0±6,15 67,1±2,63 Эозинофилы Первая 2,2±0,16 1,0±0,41* Вторая 0,8±0,40 1,7±1,08 Базофилы Первая 0,3±0,09 1,0±0,00* Вторая 0±0 0±0 Моноциты Первая 5,6±0,31 7,8±0,72* Вторая 4,0±0,38 10,6±1,36* Лимфоциты Первая 22,3±0,60 7,7±0,84* Вторая 37,3±6,49 12,2±1,49* Примечание. n1, n2 - количество опытов в первой и второй группах у собак соответственно. В обеих группах животных содержание сегментоядерных нейтрофилов в контроле не отличалось друг от друга и после действия стресса изменялось лишь в первой группе собак (увеличилось на 22%). Содержание эозинофи-лов в крови у собак первой группы уменьшалось после действия стресса на 54%. Базофилы были обнаружены только в первой группе животных, и их количество после ИС уменьшалось на 67%. После действия иммобилизации содержание моноцитов у первой группы животных увеличилось на 39%. Для второй группы собак было характерно исходно низкое содержание моноцитов, однако у них увеличение после стресса было более значительным (на 165%). ИС вызывал примерно одинаковое снижение количества лимфоцитов в крови (в первой группе на 65%, во второй - на 67%), различия по этому показателю между группами сохранялись (табл. 3). Таким образом, у крыс в результате использования различного временного интервала между инъекциями физиологического раствора и карбахолина получены разнонаправленные изменения концентрации кортикостерона после иммобилизации, а также нейтрофилез (за счет сегментоядерных нейтро-филов), моноцитопения и лимфопения. Наиболее яркие изменения картины крови наблюдали при одновременном сочетании физиологического раствора и карбахолина у животных. У собак получены результаты, указывающие на зависимость показателей крови и направленности изменений после действия иммобилизации от уровня показателей животных в контрольных опытах. Так, у собак с низким контрольным уровнем 11-ОКС в плазме крови увеличение гормонов после стресса более выражено, чем в группе животных с более высоким контрольным значением 11-ОКС. Изменения лейкограммы после иммобилизации заключались в резко выраженном нейтрофилёзе (за счёт сегментоядерных форм у животных с высоким содержанием палоч-коядерных нейтрофилов в контрольных опытах и за счет палочкоядерных форм у животных с низким уровнем их содержания в контрольных опытах), моноцитозе и лимфопении. Базофилы были обнаружены только в первой группе животных, и их количество после ИС увеличилось. Количество эо-зинофилов снижалось после ИС в группе собак с высоким их содержанием в контрольных опытах и лишь имело тенденцию к увеличению у животных с низким контрольным уровнем эозинофилов. У животных второй группы (с низким количеством палочкоядерных нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и высоким содержанием лимфоцитов) после иммобилизации уровень числовых значений эозинофилов, моноцитов и лимфоцитов был выше, а па-лочкоядерных нейтрофилов - ниже, нежели в первой группе собак. обсуждение результатов Реакция системы крови на действие чрезвычайных раздражителей формируется при участии универсальных стресс-реализующих систем, которые мобилизуют специфические механизмы, индуцирующие гемопоэз в физиологических и экстремальных условиях. В реализации отмеченных количественных сдвигов показателей периферической крови важную роль играет гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система (ГГАКС). Под влиянием возмущающих сигналов происходит переход системы ГГАКС из одного состояния в другое. Регулируют и перераспределяют поток энергии в организме гормоны стресса, которые осуществляют эту неспецифическую функцию, а на основании её строятся новые специфические механизмы адаптации. Стрессорные воздействия на организм наряду с поведенческими реакциями вызывают изменения состояния парасиматического и симпатического отделов автономной нервной системы с соответствующей модуляцией фоновых центрогенных холинергических и адренергических влияний. Одним из нейроэндокринных факторов, принимающих участие в стрессе, являются глюкокортикоидные гормоны [3, 24]. В наших экспериментах увеличение концентрации кортикостерона было зарегистрировано у крыс, которым вводили физиологический раствор за 30 мин до карбахолина после ИС (концентрацию гормонов определяли в плазме, полученной через 75 мин после инъекции физиологического раствора). У собак независимо от контрольного уровня 11-ОКС увеличение концентрации глюкокортикоидов наблюдали при одновременном введении физиологического раствора с агонистом холинорецепторов после иммобилизации (концентрацию гормонов определяли в плазме, полученной через 150 мин после инъекций). Необходимо отметить, что у собак первой группы (с низкой концентрацией глюкокортикоидов в контрольных опытах) степень повышения концентрации гормонов была выше в 1,8 раза по сравнению с показателями у собак второй группы (с высокой концентрацией кортикостероидов в контрольных опытах). Вместе с тем у крыс, которым вводили физиологический раствор одновременно с холино-миметиком после ИС, обнаружено значимое снижение концентрации кортикостерона (концентрацию гормонов определяли в плазме, полученной через 45 мин после инъекций физиологического раствора и карбахолина). Необходимо отметить, что в контрольных опытах отсутствовали различия в уровне кортикостерона у крыс, которым вводили физиологический раствор одновременно с карбахолином, и у крыс, которым вводили физиологический раствор за 30 мин до холиномиметика. С одной стороны, возможно, данные наших опытов отражают цикличность секреторных процессов в надпочечниковой системе экспериментальных животных. С другой стороны, возможно, физиологический раствор, вводимый одновременно или последовательно с холиномиметиком, самостоятельно участвует в изменении уровня кортикостероидов, так как имеются прямые указания на подобную его способность [14, 25]. Вместе с тем можно предположить, что различия в уровне глюкокорти-коидов у групп крыс, которые подвергались однотипному стрессу, определяются разными стадиями стресса, если полагать, что этому способствовало одновременное или последовательное применение дополнительных после иммобилизации раздражителей (инъекции физиологического раствора и карбахолина). Повышение секреции глюкокортикоидных гормонов отмечается при реакции тревоги, а в течение стадии истощения секреция глюкокортикоидов начинает снижаться и, наконец, падает [26, 14]. Однако трудно говорить о разных стадиях (резистентности, истощения), так как в наших экспериментах отсутствует характерная для них эозинофилия. Есть мнение, что фактически в остром стрессе существует лишь одна стадия - тревоги, если стрессор однократен и не настолько силён, чтобы приводить к стадии истощения. Стадия резистентности после реакции тревоги относится не к стрессу, а к другим реакциям на раздражители либо слабой, либо средней силы (активации, тренировки), в зависимости от степени запредельного торможения. Стадия истощения относится к хроническому или очень тяжёлому острому стрессу [14]. В ходе проведённого нами исследования у крыс и собак после иммобилизации был зарегистрирован выраженный нейтрофилёз в периферической крови вне зависимости от сочетания дополнительных факторов (физиологический раствор, карбахолин). Лейкоцитоз за счет сегментоядерных ней-трофилов наблюдали у крыс независимо от временного интервала между инъекциями физиологического раствора и карбахолина и у собак с высоким содержанием палочкоядерных нейтрофилов в контрольных опытах. Вместе с тем нейтрофилез за счет палочкоядерных форм регистрировали у собак с низким контрольным уровнем их содержания. Развитие нейтрофилеза, возможно, связано с выбросом этих клеток из костного мозга в периферическую кровь при стимуляции а-адренорецепторов. Количество моноцитов у крыс и собак после иммобилизации изменялось неоднозначно. Количество моноцитарных клеток снижалось у стрес-сированных крыс, которым физиологический раствор вводили за 30 мин до карбахолина, не изменялось у крыс с одновременным сочетанием физиологического раствора и холиномиметика после ИС, а у собак регистрировали моноцитоз в обеих группах (с высоким и низким содержанием моноцитов в контрольных опытах). Отмечена разная степень проявления моноцитоза у собак: у животных с исходно высоким содержанием моноцитов иммобилизация вызывала менее яркий ответ (увеличение на 39%), чем у животных с исходно низким содержанием моноцитарных клеток (увеличение в 2,5 раза). В эксперименте были обнаружены эозинопения и увеличение количества базофилов только у собак первой группы после иммобилизации. Данная группа животных характеризовалась исходно высоким содержанием эози-нофилов и наличием базофилов. Эозинофилы уходят из крови в соединительную ткань, где принимают активное участие в реализации функции макрофагов. Таким образом, изменения количества нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов, вероятно, определяются видовыми особенностями ответной реакции на стресс и исходным уровнем данных показателей. В то время как изменение содержания базофилов после стрессирующего воздействия, помимо видовой специфики, исходного уровня клеток, зависит от времени забора крови после иммобилизации. После ИС у всех животных отмечена лимфопения. Вероятно, в уменьшении поступления лимфоцитов в кровоток глюкокортикоиды не играли основной роли, в связи с тем что лимфопениче-ское действие стресса наблюдали как при повышении, так и при снижении уровней кортикостероидов у крыс после иммобилизации и разной степени повышения 11-ОКС у собак после стресса. Возникновение эозинопении и лимфопении может быть обусловлено преобладающим влиянием симпатической нервной системы. Так, миграция лимфоцитов в костный мозг и ткани происходит при участии Р-адренорецепторов. Даже повышенная миграция лимфоидных клеток из тимуса и селезёнки не может компенсировать их убыли из крови. Срочная мобилизация лимфоцитов при стрессе и расселение их по органам и тканям необходимы для обеспечения подготовки организма к ответу на любое нарушение гомеостаза. Из всех морфологических форм лейкоцитов число лимфоцитов составляло менее 20% как у крыс, так и у собак. По мнению некоторых исследователей, основным показателем реакции организма на внешнее воздействие является процентное содержание лимфоцитов. Менее 20% лимфоцитов в периферической крови характерно для реакции типа «стресс» и отличает её от реакции активации и тренировки [14]. Следует отметить, что согласно одному из правил саморегуляции - «правилу исходного уровня» - направление и величина изменений гомеостати-ческой константы под влиянием возмущающего фактора зависят от исходного значения константы. Здесь необходимо вспомнить, что при проведении контрольных опытов в данном эксперименте у собак были отмечены различия в величинах показателей крови, что позволило разделить животных на две группы. После иммобилизации между двумя образовавшимися группами регистрировали различные реакции по степени выраженности и направленности изменений концентрации кортикостероидов и соотношений морфологических форм лейкоцитов. По-видимому, «индивидуальная норма», обусловленная конституциональными особенностями гуморальной регуляции и структур физиологических систем, определила функциональные способности (потенциал) организма в ответ на действие стресса. Исходя из того, что сохраниться в качестве системы организм может лишь в том случае, если возмущающее воздействие автоматически вызывает активный эффект, стабилизирующий внутреннюю среду, - основным механизмом сохранения гомеостаза является саморегуляция [27]. Таким образом, применение раздражителей (инъекции физиологического раствора и карбахолина), сопряженных с выполнением данного эксперимента, одновременно или последовательно включенных в действие, оказалось весомым фактором, обусловившим ответную реакцию организма животных, подверженных иммобилизации. В результате получены адаптационные реакции разного типа с характерным комплексом изменений показателей крови. Вместе с тем индивидуальные особенности, обусловленные функциональными способностями (потенциал) организма, определили степень и направленность изменений концентрации глюкокор-тикоидов и содержание различных морфологических форм лейкоцитов в ответ на действие ИС.

Скачать электронную версию публикации