Toxic effects of carbon nanotubes in macrophage and bronchial epithelium cell cultures.pdf Одно- и многослойные углеродные нанотрубки, как одни из самых перспективных наноматериалов, получают все большее распространение. В мире наблюдается значительный рост предприятий, производящих и использующих готовые УНТ. Одновременно растет число лиц, потенциально экспонированных к аэрозолю углеродных нанотрубок на своих рабочих местах [1, 2]. Накопленные данные дают основания предположить наличие риска здоровью людей, имеющих производственный контакт с углеродными наночастицами. Волокнистая структура углеродных нанотрубок может обусловливать патогенность, свойственную минеральным волокнам (асбест, диоксид кремния) [3-5]. Существует мнение, что углеродные наноразмер-ные частицы опаснее частиц микроразмера за счет большей проникающей способности, удельной поверхности и реактогенности [6]. Целью исследования была сравнительная оценка токсических эффектов промышленных однослойных и многослойных УНТ в культурах клеток макрофагов и бронхиального эпителия. материалы и методики исследования Частицы. Одно- и многослойные углеродные нанотрубки были получены промышленным методом каталитического осаждения паров (ООО «Нанотехцентр», г. Тамбов). В растворе дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) УНТ визуально представляли собой спутанные клубки размером до 5 мкм в ширину и отдельные волокна. В таблице приведены характеристики нанотрубок, предоставленные предприятиями-производителями. Физико-химические характеристики промышленных углеродных нанотрубок Физико-химические характеристики Многослойные углеродные нанотрубки Однослойные углеродные нанотрубки Наружный диаметр, нм 8-15 1-2 Внутренний диаметр, нм 4-8 0,8-1,4 Длина, мкм 2 и более 3 и более Общий объем примесей, % д° 5 4-7 Насыпная плотность, г/см3 0,03-0,05 0,15 Удельная геометрическая поверхность, м2/г 300-320 1100 Термостабильность, °С До 600 До 700 Дозировка. УНТ были растворены вместе с ДПФХ (0,01 мкг/мл) с целью увеличения дисперсии частиц [7, 8]. С целью оценки дозозависимых эффектов в культурах были выбраны концентрации 0,02, 0,2, 2,4 и 24 мкг на см2 поверхности монослоя (0,1, 1, 10, 100 мкг/мл среды). Эти концентрации использовались в предыдущих исследованиях по сравнительной оценке токсичности углеродных частиц нано- и микроразмера [9-11]. Культуры клеток. Были взяты две линии клеток: трансформированные мышиные макрофаги RAW 264.7 и иммортализованные клетки нормального человеческого бронхиального эпителия BEAS-2B. Клетки были выращены с использованием сред MEM (Minimal Essential Media, «Gibco», США) и DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium, «Gibco», США) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в термостатах (37°C, 5% CO2). Клетки были засеяны в 96-луночные планшеты в количестве около 2 000 на лунку. В культурах клеток непосредственно в среде были измерены уровни лактатдегидрогеназы (ЛДГ) как маркера повреждения клеточных мембран [12]. В лизатах культур с помощью реагента ThioGlo® («Calbiochem», США) определялись уровни внутриклеточного глутатиона для косвенной оценки активности свободнорадикального окисления. Жизнеспособность клеток определялась методом флюоресценции. Часть клеток (RAW 264.7, экспонированные к МУНТ и ОУНТ, концентрация 0,2 мг/см2, через 2, 4, 6, 24 и 48 ч) была собрана, отмыта и отброшена на стекла для изучения с помощью улучшенной темнопольной микроскопии («CytoViva®», США). Статистическая обработка проводилась с использованием t-критерия Стьюдента в программном пакете Microsoft Excel 2010. Данные представлены в виде средней ± ошибка средней. Отличия считались статистически значимыми при p < 0,05. Результаты исследования и обсуждение Для исследования нами были взяты мышиные макрофаги RAW 264.7, так как именно макрофаги являются клетками, запускающими и поддерживающими различные типы иммунных ответов в случаях контакта с инородным материалом [13]. Внесение МУНТ в культуру RAW 264.7 не вызвало достоверного снижения жизнеспособности (рис. 1, А), однако сопровождалось повышением концентраций ЛДГ во внеклеточной среде через 48 ч при всех дозировках (но не через 24 ч) (рис. 1, Б). Оксидативный стресс имел дозо- и времязависимый характер (рис. 1, В): уровни внутриклеточного восстановленного глутатиона снижались с повышением дозы и времени воздействия (для самой высокой дозы). Внесение ОУНТ в культуру RAW 264.7 привело к снижению жизнеспособности на 10-15% через 24 ч после экспозиции независимо от дозы. Спустя 48 часов при 2,4 мкг/см2 ОУНТ жизнеспособность снизилась до 78%, а при 24 мкг/см2 - до 50% от уровня неэкспонированных клеток (рис. 2, А). Уровни ЛДГ резко выросли через 48 ч при концентрациях 0,2, 2,4 и 24 мкг/см2 (рис. 2, Б), что в целом совпало с зафиксированным снижением жизнеспособности в тех же группах. Было обнаружено значительное снижение уровней восстановленного глутатиона: чем больше были экспозиционная доза и время воздействия, тем ниже уровни (рис. 2, В). Клетки бронхиального эпителия BEAS-2B, играющие ведущую роль в эвакуации пылевых частиц из дыхательного тракта, оказались маловосприимчивы к внесению МУНТ: через 24 и 48 ч не было зафиксировано достоверного снижения жизнеспособности по сравнению с контрольной культурой. Такие же результаты были получены при оценке показателей повреждения клеток и оксидативного стресса (данные не приведены). МУНТ, мкг/см2 24ч 48ч 120 100 80 60 40 20 0 £ Р о я а н и и о СО 0,02 0,2 А 120 £ I 100 5 % ^ 80 60 40 20 X 2 2 8 7 6 5 3 1 0 24 мУнТ, мкг/см2 ■ 24 ч 48 ч Рис. 1. Результаты внесения многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ) в культуру RAW 264.7 макрофагов. * - p < 0,05 vs. контроль, а - p < 0,05 vs. 24 ч §"8 4 0,02 0,2 В мУнТ, мкг/см2 24ч 48ч 120 80 60 40 20 0 0,02 0,2 2,4 24 ОУНТ,мкг/см2 ■ 24 ч И48 ч А 0 й 100 П § & ^ о S3 = л § ь н = о а о И 120 I 100 & 40 80 60 20 0 0,02 0,2 2,4 24 ОУНТ,мкг/см2 ■ 24 ч ■ 48 ч Б 0 Н 5 12 S 10 8 6 4 2 0 0,02 0,2 2,4 24 ОУНТ, мкг/см2 ■ 24 ч И48 ч В 0 р и Й 3 ® »© 8 О S

Скачать электронную версию публикации