Cryopreservation of chlorophyllous spores of East Asian ferns.pdf Введение Данные о длительности периода, в течение которого споры папоротников умеренных широт сохраняют жизнеспособность, противоречивы. По некоторым данным, не содержащие хлорофилла споры сохраняют жизнеспособность в течение нескольких лет, известны случаи прорастания спор отдельных видов после 15-20 лет хранения в гербарии [1-5]. Но, по мнению большинства исследователей, споры папоротников относительно быстро теряют способность к прорастанию под воздействием внешней среды. При комнатной температуре бесхлорофилльные споры могут сохранять всхожесть от нескольких месяцев до 2-3 лет [2, 6, 8-10]. Не содержащие хло-ропластов споры обладают периодом индуцированного покоя: число проросших спор увеличивается спустя 1-6 мес хранения на холоде [11]. Период хранения при пониженных температурах увеличивается, например, споры Athyrium filix-femina при температуре от 0 до +5°C жизнеспособны 3 года [4]. Споры видов Matteuccia, Onoclea, Osmundastrum, содержащие хлоропласты, физиологически активны сразу после созревания, не имеют периода покоя и быстро теряют жизнеспособность при хранении [12, 13]. Возможными причинами потери жизнеспособности называют биохимические и метаболические факторы, нарушение процессов дыхания и целостности мембран, инактивацию ферментов и гормонов роста [14]; генетические факторы, например хромосомные мутации [15], утрату способности к фотосинтезу после высыхания [16]. В процессе хранения первыми подвергаются распаду зеленые пигменты, хлорофиллы a и b распадаются полностью [2, 17]. В сохранении растений ex situ большое значение имеют банки зародышевой плазмы. В настоящее время в генных банках преимущественно сосредоточены геномы семенных растений, для продления жизни которых применяется хранение при пониженных температурах. Исследования, проведенные за рубежом и в России, показали, что наиболее эффективна криоконсервация, или замораживание в жидком азоте (-196°C) [18-20 и др.]. Вопрос о долговременном хранении генетического материала сосудистых споровых растений менее изучен. Первый банк спор папоротников был создан в Королевском Ботаническом саду г. Эдинбург [15]. Исследования влияния криоконсервации на споры начались в девяностых годах ХХ в. [21, 22] и продолжились в начале нового века [10, 12, 13, 23-28]. Метод криоконсервации применялся сначала к спорам тропических видов папоротников [21], а позже - к спорам папоротников умеренной климатической зоны [22-24, 26]. Однако подобных работ немного, и число изученных видов невелико. В дальневосточном регионе исследования устойчивости зеленых, содержащих хлоропласты спор папоротников к замораживанию при температуре жидкого азота ранее не проводились. На Дальнем Востоке России произрастают 5 видов папоротников, имеющих содержащие хлорофилл споры. Два из них (Osmundastrum pilosum, Mat-teuccia orientalis) - редкие виды и внесены в региональные красные книги и Красную книгу России. Matteuccia struthiopteris и Osmundastrum asiaticum являются пищевыми растениями и издавна известны в кулинарии азиатских народов. Заготовка их в некоторых районах российского Дальнего Востока в конце ХХ в. имела почти промышленные масштабы для экспорта в Корею и Китай. Эти виды обладают выраженными лекарственными свойствами и применяются в народной медицине. Onoclea interrupta и вышеперечисленные папоротники высокодекоративны и активно используются в озеленении. Значительную опасность для популяций этих папоротников представляет активное изменение биоценозов человеком. Вырубка лесов, строительство дорог, нефтепровода, газопровода, затопление или осушение, разработка и преобразование территорий влекут за собой уменьшение числа популяций этих видов и численности особей в них. Цель работы: изучить влияние глубокого замораживания на жизнеспособность хлорофиллсодержащих спор папоротников Восточной Азии и оценить возможность применения криоконсервации как метода долговременного хранения спор. Материалы и методики исследования Материалом для исследований послужили хлорофиллсодержащие споры папоротников, произрастающих на российском Дальнем Востоке. Matteuccia struthiopteris (L.) Tod. - страусник обыкновенный. Голарктический вид, широко распространенный на территории Восточной Азии. Используется в пищу, применяется в народной медицине. Matteuccia orientalis (Hook.) Trev. - страусник восточный. Восточноази-атский вид, в России находится на северо-восточной границе ареала. Известно до 5 местонахождений в Сахалинской области и Приморском крае. Редкий вид, внесен в красные книги Сахалинской области и Приморского края, категория - «уязвимый» [29, 30]. Osmundastrum asiaticum (Fern.) Tagawa - чистоустник азиатский. Восточ-ноазиатский вид, произрастающий в Приморском и Хабаровском краях, Еврейской автономной и Сахалинской областях и в южных районах Амурской области. Используется в пищу, является объектом заготовок в промышленном масштабе для экспорта. Osmundastrum pilosum (Wall. ex Grev. еt Hook.) Schmakov (= O. claitonia-num (L.) Tagava) - чистоустник волосистый. Восточноазиатский вид, в России произрастает на северной границе ареала. Встречается на юге Приморского и в Хабаровском краев. Редкий вид, внесен в Красную книгу России и региональные красные книги, категория - «уязвимый» [29-31]. Onoclea interrupta (Maxim.) Ching et P.C. Chiu (= O. sensibilis auct. non L.) -оноклея прерывистая. Широко распространенный восточноазиатский вид. Споры папоротников собирали в июне (виды Osmundastrum) и осенью (представители родов Matteuccia и Onoclea) в естественных популяциях на территории Амурской области и в коллекциях Ботанического сада-института ДВО РАН (г. Владивосток), Центрального сибирского ботанического сада СО РАН (г. Новосибирск). Вайи или доли второго порядка (у видов с большим размером вай) помещали в бумажные пакеты и располагали в затененном хорошо проветриваемом месте до высыпания спор из спорангиев. Одну часть свежесобранных спор оставляли в бумажных пакетах и хранили в лаборатории. Один раз в месяц проверяли их всхожесть. Другую часть материала закрывали в криопробирки и погружали в жидкий азот (-196°C). Время экспозиции 14 дней. Размораживание проводили на воздухе в лаборатории при температуре +20...+22°C. Контрольные образцы не подвергали замораживанию. Споры проращивали в чашках Петри диаметром 12 см с дистиллированной водой. В каждой чашке с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 в пяти полях зрения подсчитывали и затем суммировали проросшие и непроросшие споры. Для каждого исследуемого вида папоротника значимость различий проросших и непроросших спор в контроле и эксперименте проверяли по критерию х2 с использованием четырехпольной таблицы вариант [32. С. 29]. На уровне значимости W = 0,05 различие считали существенным, если вычисленное значение критерия х2 превышало табличное значение. Жизнеспособность спор оценивали по всхожести. Всхожесть выражали в процентах как отношение числа проросших спор к сумме проросших и непроросших. Результаты исследования и обсуждение Свежесобранные споры M. struthiopteris имели высокую всхожесть -95%. В результате регулярного тестирования выявлена динамика снижения всхожести при хранении в лабораторном помещении (рис. 1). За месяц всхожесть снижалась почти на 80%. Через два месяца после сбора прорастали менее 10% спор. Всхожесть спор, хранившихся четыре месяца, составляла около 1%, через семь месяцев хранения споры теряли жизнеспособность, всхожими оставались менее 1% . Хранение, месяц Рис. 1. Снижение всхожести спор Matteuccia struthiopteris при хранении в лабораторном помещении Fig. 1. Decrease in Matteuccia struthiopteris spores germination during storage in a laboratory (on the ordinate axis - Germination ability (%), on the abscissa axis - Storage (months)) Хлорофиллсодержащие споры сохраняют способность к прорастанию от нескольких дней до нескольких месяцев [10, 12, 13, 33]. Этот показатель зависит как от внешних факторов среды, так и от биологических особенностей вида. Например, споры Hymenophyllaceae и Grammitidaceae жизнеспособны до двух недель и начинают прорастать, еще находясь в спорангии [10]. Споры Osmunda regalis L. более жизнеспособны - всхожесть сохраняется около месяца. По данным R.M. Lloyd и E.J. Klekowski Jr. (1970) [34], жизнеспособность спор некоторых видов Onoclea и Matteuccia сохраняется на протяжении 1 года. Споры M. struthiopteris потеряли способность к прорастанию за семь месяцев хранения, что характеризует их биологическую недолговечность. Всхожесть резко снижается в течение первого месяца (на 80%, см. рис. 1), поэтому для практических целей необходимо использовать свежесобранные споры. Наши результаты дополняют ранее полученные данные о кратковременном хранении зеленых спор папоротников при комнатной температуре; разработка методов длительного хранения спор такого типа в настоящее время достаточно актуальна. Споры изучаемых видов папоротников подвергли замораживанию в жидком азоте (-196°C). Результаты эксперимента представлены в таблице. Всхожесть хлорофиллсодержащих спор папоротников / Germination of chlorophyll-containing fern spores Вид / Species Споры, число / Spores, number Критерий, х2*/ Criterion, х2* Всхожесть, % / Germination ability, % Проросшие / Germinated Непроросшие / Undergerminated 1 2 1 2 1 2 Matteuccia struthiopteris 517 447 25 148 88,7 95 75 M. orientalis 242 210 198 286 15,5 55 42 Osmundastrum asiaticum 449 211 43 213 192,7 91 50 O. pilosum 305 129 22 176 186,4 93 42 Onoclea interrupta 331 221 81 170 51,8 80 56 Примечание. 1 - контроль, 2 - эксперимент (-196°C); * если х2 вычисленное > 3,841, различия статистически значимы / Note. 1 - control, 2 - experiment (-196°C); * if х2 > 3.841, statistically significant difference. До замораживания (контроль) споры четырех изученных видов имели всхожесть от 80 до 95% и только споры одного вида (Matteuccia orientalis) отличались более низкой всхожестью - менее 60%. Споры всех изученных видов реагировали на глубокое замораживание. Анализ полученных данных показал, что после криоконсервации всхожесть статистически значимо снизилась. Наиболее значительное снижение наблюдалось у видов рода Osmundastrum - почти в 2 раза по сравнению с контрольным значением. Однако в целом через 14 дней хранения в жидком азоте осталось от 42% (Matteuccia orientalis, Osmundastrum pilosum) до 75% (Matteuccia struthiopteris) спор, способных к прорастанию (таблица). В лабораторных условиях через месяц хранения всхожесть спор Matteuccia struthiopteris снизилась на 80%, а после криоконсервации - на 20%. Этот факт говорит о том, что применение метода криоконсервации для хранения хлорофиллсодержащих спор дальневосточных папоротников можно считать перспективным. В криобанках хранение генетического материала не ограничено по времени, поэтому полученные результаты согласуются с данными зарубежных исследователей [13]. Кроме того, S. Magrini и A. Scoppola [35] отмечают, что низкие температуры стимулируют быстрое прорастание спор и развитие гаметофитов (если сравнивать со спорами, хранившимися при пониженных температурах - от +5°С до -5°С). Интенсивность развития гаметофитов и прорастания спор, хранившихся при отрицательных температурах, близки к показателям свежесобранных спор. В эксперименте всхожесть зеленых спор дальневосточных папоротников снизилась на 13-50% в зависимости от вида (таблица). У бесхлорофилльных спор после размораживания всхожесть чаще всего остается на уровне контроля или возрастает, в редких случаях наблюдалось незначительное снижение [26-28]. Большая потеря жизнеспособности зелеными спорами объясняется, возможно, их более высокой влажностью. Например, споры представителей рода Osmunda содержат около 17% влаги [10], в то время как у бесхлорофилльных спор папоротников влажность составляет от 4% [33]. Кроме того, в зеленых спорах содержится меньше гранул липидов, чем в бесхлорофилльных спорах [10], что, возможно, приводит к повреждению при замораживании. Зарубежные исследования показали, что зеленые споры переносят глубокое замораживание, если сразу после сбора их подсушивают на воздухе или в силикагеле [12, 13, 21], а затем помещают в жидкий азот. Однако высушивание не должно быть полным, так как сильное обезвоживание приводит к невозможности фотосинтеза и потере жизнеспособности [16]. Эксперименты S. Magrini и A. Scoppola [35] показали, что всхожесть спор, не подвергавшихся предварительной сушке, значительно выше, чем предварительно высушенных. Относительная влажность воздуха в разных частях света различна, на побережье она значительно выше, чем внутри континента [10]. Излишняя влажность воздуха отрицательно сказывается на хранении спор папоротников. Вероятно, поэтому данные D. Ballesteros [Там же] о терпимости зеленых спор к высушиванию противоречат данным S. Magrini с A. Scoppola [35]. Мы полагаем, что при высокой влажности воздуха зеленые споры необходимо подсушивать перед криоконсервацией. В наших экспериментах замораживанию подвергались споры с равновесной влажностью, которые предварительно подсушивались на открытом воздухе в лаборатории. Выводы Хлорофиллсодержащие споры Matteuccia struthiopteris полностью теряют жизнеспособность при хранении в лабораторных условиях в течение 7 месяцев. Экспериментально выявлена устойчивость хлорофиллсодержащих спор 5 видов дальневосточных папоротников к глубокому замораживанию. Несмотря на то, что всхожесть спор Matteuccia, Osmundastrum, Onoclea статистически значимо снижается, криоконсервация не вызывает полной потери способности к прорастанию. В зависимости от вида после размораживания сохраняется от 42% (Matteuccia orientalis, Osmundastrum pilosum) до 75% (Matteuccia struthiopteris) жизнеспособных спор. Криоконсервация может рассматриваться как перспективный метод долговременного хранения зеленых спор папоротников Восточной Азии.

Скачать электронную версию публикации