Antimicrobial complex Enterococcus mundtii PPHS-5/13 of peptide nature.pdf Введение Стремительный рост устойчивости микроорганизмов к антибиотикам создал ряд серьезных проблем в лечении инфекционных болезней микробной этиологии. В связи с необходимостью поиска новых лекарственных средств, в результате быстрого появления лекарственно устойчивых форм микроорганизмов, подавления иммунитета, аллергизации организма, обусловленных частым применением антибиотиков, на сегодняшний день все больше востребованы новые средства естественного происхождения с антимикробным действием [1, 2]. В качестве претендентов на такую роль часто рассматриваются пробиотические бактерии, бактериофаги и бактериоцины [3-6]. Если пробиотические бактерии после колонизации на слизистых действуют комплексно, продуцируя метаболиты с антимикробным действием, то бактериофаги и бактериоцины - избирательно. Считается, что бактериоцины, в отличие от вирусов бактерий, более безопасны для потребления человеком [7]. Кроме того, близкий к антибиотикам антимикробный потенциал бактери-оцинов делает их весьма перспективным объектом исследований, претендующих на роль антимикробных средств естественного происхождения [8, 9]. Бактериоцины и бактериоциноподобные ингибирующие субстанции (bacteriocin-like inhibitory substances - BLIS) представляют собой низкомолекулярные пептиды, обладающие антимикробным действием [5, 8, 9]. Их могут вырабатывать не только микроорганизмы, но и растения, насекомые, а также животные [1, 10, 11]. Бактериоцины отличаются от антибиотиков по своему происхождению: если первые синтезируются на рибосомах, то вторые - без их участия при помощи специальных ферментов [7, 12]. Наиболее известными бактериоцинами с 60-летней историей применения являются низин и его стандартизованный вариант низаплин [13], выпускаемый английской компанией «Aplin&Barrett Ltd» [14, 15]. Недостаток низина - узкий спектр антимикробной активности и стабильность лишь в области кислых значений рН. В связи с этим поиск новых бактериоцинов, отвечающих требованиям потребителей и производителей, - актуальный вопрос и для нашей страны. К сожалению, изучение бактериоцинов в России ведется в недостаточной степени [16]. При поиске новых продуцентов бактериоцинов рекомендовано обращать внимание на «практически безопасные» (generally recognized as safe - GRAS) микроорганизмы [7]. Этим требованиям удовлетворяют некоторые виды энтерококков, продуцирующие более двух десятков энтероцинов бактериоцинов энтерококков [17, 18]. Наиболее привлекательными в этом плане являются негемолитичные виды Enterococcus: E. faecium и E. mundtii, способные вырабатывать бактериоцины класса II [17-19]. Выделенный нами штамм E. mundtii PPHS-5/13 способен накапливать в ферментате бактериоцидные вещества, однако его природа оставалась неизвестной. Цель исследования - определение условий получения и выделения антимикробной субстанции, продуцируемой штаммом Enterococcus mundtii PPHS-5/13, изучение ее природы и возможности практического использования. Материалы и методики исследования Материалом для исследования послужили штамм энтерококкового микроорганизма, выделенного из молока, и вырабатываемый им антимикробный комплекс веществ [20]. Штамм PPHS-5/13, идентифицированный с применением MALDI Biotyper (Bruker Daltonik GmbH), генетических 16SrDNA методов, биохимических тестов API® (BioMerieux) и морфокультуральных признаков как Enterococcus mundtii, был депонирован в Государственной коллекции «ГКПМОболенск» (№ В-7424). В качестве индикаторных культур для оценки антимикробной активности образцов энтероцина использовали микроорганизмы из коллекции Центра. В качестве питательных сред использовали коммерческие Nutrient Agar M001 и MRS-broth, HiMedia, (Индия), ГРМ-агар, ГРМ-бульон (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия) и экспериментальные варианты. При отработке условий глубинного культивирования штамма E. mundtii PPHS-5/13 опыты проводили в качалочных колбах объемом 700 мл с 200 мл питательной среды при температуре 34±2°С. Базовая среда включала (г/л): солянокислотный гидролизат казеина (5-10), дрожжевой экстракт (5-7), натрия хлорид (3-5), магния сульфат (0,3-0,5). Другие исследуемые компоненты (углеводы, фосфаты, цитраты, азид натрия) в базовую пропись вносили отдельно. Контролем являлось выращивание бактерий на MRS-бульоне - традиционной среде для глубинного культивирования большинства лактобактерий. Среды стерилизовали при 0,5 ати 30 мин. Варианты питательных сред, давшие лучшие результаты по уровню антимикробной активности в опытах на колбах, апробированы при культивировании штамма в 10 л ферментере NBS, модель 511 (США), с 6,5 л питательной среды, где дополнительно оптимизировали условия по перемешиванию, аэрации и продолжительности выращивания. Для определения бактерицидной активности пробы культуральной жидкости (КЖ) освобождали от клеток на микрофуге MiniSpain (13000 об/мин, 10 мин в «Ep-pendorf AG 22232», Germany) и по 10 мкл наносили на свежезасеянные газоны тест-штамма Listeria monocytogenes 776. Антимикробную активность количественно выражали в арбитражных единицах (Аи; взяты из общепринятого англоязычного обозначения arbitration units, аналогичного аббревиатуре МПК -минимальная подавляющяя концентрация), отнесенных к 1 мл или 1 мг пробы. Для ее определения тестируемую жидкость разводили с двукратным шагом (1:1) в физрастворе в 512 раз (1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16...1:512) или более. Из каждого разведения отбирали по 10 мкл и наносили на питательный агар в чашке Петри, которая перед этим засевалась тест-штаммом; инкубировали в течение ночи при 36°С. При учете антимикробной активности отмечали то максимальное разведение пробы, в котором заметна зона отсутствия роста тест-штамма. Если, например, в разведении 1:64 наблюдалась зона ингибирования индикаторного микроорганизма, то с учетом ее количества (10 мкл) активность пробы в единице объема (1 мл) составила 6400 Аи. Удельные скорости накопления бактериоцидного комплекса (qp, ч-1) рассчитывали по формуле q = AP/XAt, где Р - концентрация антимикробных веществ (мг/мл), t - время (ч), X - биомасса (мг/мл). Отработка метода выделения BLIS из культуральной жидкости включала выбор способа ее разделения (центробежное, мембранное) с последующей сепарацией бесклеточной жидкости при помощи классических методов -высаливания, сорбции, на границе фаз и их модификаций со сбором преципитатов, интерфазных пленок, их отмывкой, концентрированием, оценкой активности и физико-химических свойств [20]. Первичное определение молекулярной массы образцов BLIS проводили методом трицин-SDS-PAG электрофореза в камере фирмы «Hoefer» (США) по Shagger [21]. После окраски и отмывки гелиевую пластину помещали в стерильные чашки Петри и заливали агаровой суспензией индикаторного штамма (1 мл взвеси клеток смешивали с 15 мл расплавленного и охлажденного до 45°С ГРМ-агара с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта). После инкубации чашек в термостате (37°С) в течение 18-20 ч отмечали наличие и расположение зоны подавления роста тест-культуры на агаре с привязкой к белковым маркерам молекулярных весов PageRuler™ или SpectraTMMulti-color. Хроматографический анализ образцов BLIS проводили методом гель-фильтрации с помощью жидкостного хроматографа Acta Purifier 10 (GE HealthCare, США) на колонке для ВЭЖХ Luna 5u C18(2) 100A 250x4,6 mm (Phenomenex) с обработкой полученных данных по программе UNICORN 5.31 (Швеция). Определение молекулярного веса пептида E. mundtii PPHS-5/13 проводили на основе данных исследований лазерной десорбции и ионизации из матрицы времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF, Bruker Daltonics, Германия) по протоколу для анализа белков [22]. Антимикробная активность BLIS в натурных условиях испытывалась на тушках охлажденных коммерческих бройлеров. Для этого снятую кожу растягивали по поверхности стерильной марли в лотке и с помощью стального пробойника из нее нарезали кружки площадью около 4,5 см2, которые вкладывали в чашки Петри диаметром 35 мм внешней стороной наружу и по 100 мкл инфицировали смесью листерий и сальмонелл в концентрации 2,5x108 клеток/мл каждого вида. На контрольные образцы кожи в таком же количестве наносили стерильный 0,9% раствор NaCl (физраствор). После 30 мин экспозиции при комнатной температуре инфицированные поверхности кож орошали жидким BLIS PPHS-5/13 (100 мкл/пробу), чашки с пробами закрывали крышками и на 45 мин помещали в холодильник (47°С). Затем все образцы кожи (опытные и контрольные) промывали стерильным физраствором (по 3 мл). Из накопившейся жидкости отбирали и высевали на питательный агар пробы для оценки в них общего микробного числа, которое определяли по количеству выросших колоний. Количественную оценку результатов экспериментов представляли после их обработки с помощью программы MS Excell. Результаты исследования и обсуждение Для накопления практически значимых количеств бактериоцидного комплекса в культуральной жидкости (КЖ) при глубинном культивировании продуцента требовалось определить состав питательной среды и подобрать температурно-временные параметры выращивания штамма в опытах на колбах и затем в ферментере. В результате выполненных исследований установлено, что антимикробная активность бесклеточного супернатанта, обусловленная накоплением бактериоцидного комплекса при глубинном культивировании штамма E. mundtii PPHS-5/13, зависела от компонентного состава питательных сред (табл. 1). Т а б л и ц а 1 [T a b l e 1] Антимикробная активность образцов бесклеточного супернатанта культуральной жидкости штамма Enterococcus mundtii PPHS-5/13 при нейтральном значении рН в зависимости от компонентного состава питательных сред [Antimicrobial activity of Enterococcus mundtii PPHS-5/13 cell-free cultural supernatant samples at neutral pH depending on the component composition of nutrient media] Среда (№) [Medium] 1 2 3 4 5 6 Состав, г/л [Composition, g/L] HC (5), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,3) HC (6), YE (6), NaCl (4), MgSO4 (0,3) HC (7), YE (7), NaCl (3), MgSO4 (0,3) HC (8), YE (7), NaCl (3), MgSO4 (0,3) HC (9), YE (7), NaCl (3), MgSO4 (0,3) HC (10), YE (7), NaCl (3), MgSO4 (0,3) АА, АU/ml 400 400-800 800 800-1 600 1 600-3 200 1 600-3 200 Среда (№) [Medium] 7 8 9 10 11 12 Состав, г/л [Composition, g/L] HC (10), YE (6), NaCl (4), MgSO4 (0,3) HC (10), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,3) HC (10), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5) HC (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5) HC (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), Gly (1) HC (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), SA (1) АА, АU/ml 1 600-3 200 1 600-3 200 1 600-3 200 1 600-3 200 3 200-6 400 1 600-3 200 Среда (№) [Medium] 13 14 15 16 17 18 Состав, г/л [Composition, g/L] GK (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), SA (3) GK (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), Gly (1), К2НРО4 (3) GK (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), SC (1) GK (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), SC (3) GK (9), YE (5), NaCl (5), MgSO4 (0,5), SC (1), К2НРО4 (3) MRS-broth 100% (55) АА, АU/ml 1 600 3 200-6 400 3 200 3 200 3 200-6 400 3 200 О к о н ч а н и е т а б л. 1 [T a b l e 1 (end)] Среда (№) [Medium] 19 20 21 22 23 24 Среда (№) [Medium] 1 2 3 4 5 6 Состав, г/л [Composition, g/L] MRS-broth 50% (27,5) MRS-broth 10% (5,5) GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), L (10) GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), L (10), К2НРО4 (3) GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), L (20), К2НРО4 (3) GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), S (10) АА, Аи/ml 3 200 1 600-3 200 6 400-12 800 6 400-12 800 12 800 12 800 Среда (№) [Medium] 25 26 27 28 29 30 Состав, г/л [Composition, g/L] GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), S (10), К2НРО4 (3) GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), S (20), К2НРО4 (3) GK (9), YE (5), NaCl (3), MgSO4 (0,5), S (20), SA (1), КЛРО, (3) MRS-broth 10% (5,5) + SA (1) MRS-broth 10% (5,5) + SC (1) MRS-broth 10% (5,5) + Gli (1) АА, Аи/ml 12 800 12 800-25 600 "12 800 1 600-3 200 3 200-6 400 3 200 Примечание. GK - гидролизат казеина, YE - дрожжевой экстракт, L - лактоза, S -сахароза, Gly - глицерин, SA - азид натрия, SC - цитрат натрия, MRS-broth - MRS-бульон (контрольная среда). АА - антимикробная активность против тест-штамма Listeria monocytogenes 776 в арбитражных единицах. [Note (the columns of the table display the numbers, the composition of the nutrient medium (g/L) and the values of antimicrobial activity of the samples of the cultural liquid, which were obtained in these media)]: GK - hydrolyzed casein, YE - yeast extract, L - lactose, S - sucrose, Gly - glycerol, SA - sodium azide, SC -sodium citrate, MRS-broth - control medium. АА - antimicrobial activity against the test strain of Listeria monocytogenes 776 in arbitration units (AU) per ml of the sample]. Лучшие результаты получены в среде № 26: BLIS, выделенная из супернатанта данной среды, в 4-8 раз активнее, чем полученная при выращивании продуцента в контрольном MRS-бульоне. Цитрат и азид натрия обеспечивали лишь функции селективных добавок, фосфаты в первую треть периода культивирования препятствовали падению рН ниже 5 единиц, а глицерин как источник углерода существенно хуже, чем лактоза и сахароза. Максимальный выход BLIS PPHS-5/13 наблюдался у 12-часовой культуры при переходе микроорганизмов в стационарную фазу роста (рис. 1). Далее с продолжением времени культивирования до 24 ч накопление BLIS постепенно падает, что связано с исчерпанием в среде питательных веществ и увеличением концентрации кислых продуктов. Дальнейшему росту активности КЖ способствовало рН-статирование (6,0±0,5) в сочетании с ведением процесса инкубации при температуре 33±1°С (табл. 2). Время, часы Рис. 1. Удельные скорости накопления антимикробного комплекса Enterococcus mundtii PPHS-5/13 [Fig. 1. Specific accumulation rate of antimicrobial complex Enterococcus mundtii PPHS-5/13 (on the ordinate axis - rate of accumulation, qp, h-1 х 10; on the abscissa axis - time of cultivation, hours)] Т а б л и ц а 2 [T a b l e 2] Антимикробная активность (АА) образцов бесклеточного супернатанта культуральной жидкости Enterococcus mundtii PPHS-5/13 в зависимости от температуры, рН и продолжительности выращивания штамма [Antimicrobial activity (AA) of Enterococcus mundtii PPHS-5/13 cell-free supernatant cultural liquid samples depending on temperature, pH and duration of the growing strain] Условия роста (температура, рН, время) [Growth conditions (temperature, pH, time)] 30±0,5°С; рН 7,0...4,3; в течение 12 ч [within 12 h] 30±0,5°С; рН 7,0.4,1; в течение 24 ч [within 24 h] 30±0,5°С; рН 5,8.6,2; в течение 12 ч [within 12 h] 30±0,5°С; рН (5,8.6,2); в течение 24 ч [within 24 h] АА, AU/ml 6 400 6 400 6 400-12 800 6 400 Условия роста (температура, рН, время) [Growth conditions (temperature, pH, time)] 33±1°С; рН 7,0.4,2; в течение 12 ч [within 12 h] 33±1°С; рН 7,0.3,9; в течение 24 ч [within 24 h] 33±1°С; рН (6,0±0,2); в течение 12 ч [within 12 h] 33±1°С; рН (6,0±0,2); в течение 24 ч [within 24 h] АА, Аи/ml 12 800 12 800 12 800-25 600 12 800 О к о н ч а н и е т а б л. 2 [T a b l e 2 (end)] Условия роста (температура, рН, время) [Growth conditions (temperature, pH, time)] 37±1°С; рН = 7,0...4,0; в течение 12 ч [within 12 h] 37±1°С; рН = 7,0.3,9; в течение 24 ч [within 24 h] 37±1°С; рН (6,0±0,2); в течение 12 ч [within 12 h] 37±1°С; рН (6,0±0,2); в течение 24 ч [within 24 h] АА, AU/ml 12 800 6 400-12 800 12 800 6 400-12 800 Примечание. AU/мл - арбитражные единицы антимикробной активности образцов на миллилитр пробы против тест-штамма Listeria monocytogenes 776. [Note. AU/ml - arbitrary units of antimicrobial activity of samples per milliliter against the test strain of Listeria monocytogenes 776]. В условиях улучшенной массопередачи ферментера накопление бактери-оцидной субстанции клетками штамма PPHS-5/13 в процессе их глубинного культивирования становилось еще более стабильным (табл. 3). Т а б л и ц а 3 [T a b l e 3] Параметры культивирования штамма Enterococcus mundtii PPHS-5/13 в 10 л ферментера и показатели бесклеточной жидкости [Cultivation parameters of the strain Enterococcus mundtii PPHS-5/13 in 10-L fermenter and indicators of cell-free liquid] Время роста, ч [Growth time, h] Температура, °С [Temperature, °С] Поддержание рН* [рН* support] Перемешивание, об/мин [Mixing, r/ min] Аэрация, л/мин [Aeration, L/min] Достигаемые выходы [Achieved outputs] OD (550 нм) АА КЖ [AA CL] 11,0±1,5 33,0±1,0 6,0±0,5 220-450 3±1 2,8±0,6 12 800-25 600 ----' _^^_~ " _^^_^^_^^------_----' _^^----------- Примечание. * - при помощи 20% КОН; OD - оптическая плотность культуральной жидкости; АА КЖ - антимикробная активность в отношении Listeria monocytogenes шт. 776, в арбитражных единицах (AU/мл). [Note. The columns of the table contain data about the values of monitored parameters. * the adjustment of pH was carried out using 20% KOH solution; OD - the optical density of the cultural liquid; AA CL -antimicrobial activity against Listeria monocytogenes 776 in arbitrary units (AU/ml)]. В дальнейшем требовалось отработать способ извлечения BLIS из КЖ. Для этого КЖ освобождают от клеток (центрифуга «Beckmann», 8 000 об/мин, 5°С, 45 мин) и упаривают в 6-10 раз на роторном вакуумном испарителе (Heidolph, модель Laborota 4000, Германия, при 60°С), чтобы снизить объем перерабатываемой жидкости. Применение мембранной технологии оказалось неприемлемым из-за существенной потери антимикробной активности фильтрата, обусловленной налипанием BLIS на полые волокна фильтрационного патрона. Далее концентрат супернатанта при отсутствии возможности его переработки в день получения замораживают и хранят при температуре не выше (-12)°С либо распылительно высушивают на установке Mini Spray Dryer Buchi B-190 (Швейцария) при следующих параметрах: температура входа/выхода - 130°С/90°С, подача жидкости - около 17 мл/мин. Получаемый сухой порошок с остаточной влажностью не более 6% и антимикробной активностью от 400 до 1000 Аи/мг может быть использован непосредственно для приготовления кормовых добавок для животных, лечебных деконтаминирующих растворов, либо как сырьё для отработки способа выделения BLIS, ее очистки и определения свойств. Отработка способа выделения и очистки BLIS проводилась как из бесклеточной жидкости, так и регидратированного порошка с использованием приемов высаливания, сорбции и межфазного разделения. При использовании метода солевой преципитации в отмеренный объем бесклеточного супернатанта (нативного/замороженного-оттаянного/реги-дратированного) дробно с перемешиванием вводили навеску сульфата аммония до концентрации 60%, выставляли на холод (4...7°С) и далее центрифугировали (25 000 G, 20 мин, при 5°С). Надосадочную жидкость удаляли, к осадку добавляли 50-100 мл воды до полного растворения осадка; полученный раствор диализовали (мешок H1, размер пор 3,5 кДа) против дистиллированной воды в течение суток. Установлено, что выход по отношению к суммарному расчетному количеству бактериоцина составил до 30%, а по времени процесс выделения занимал около 2 сут (табл. 4). Т а б л и ц а 4 [T a b l e 4] Показатели образцов BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 в зависимости от способа обработки супернатанта [The indicators of samples BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 depending on a supernatant treatment method] Способы и средства выделения [Methods and means of excretion] Выход [Output], Аи/ml Затраты по времени [Time costs] Высаливание [Salting-out] (NH4)2SO4 51 200±7 400 Около 2 суток [About 2 days] Сорбция на твердых носителях [Adsorption on solid media] Силикагель 100/250 [Silica gel 100/250] 51 200±4 500 Около суток [About 1 day] Al2O3 12 800±3 700 То же [The same] Аэросил А-300 [Aerosil А-300] 51 200±8 100 То же [The same] Смола КБ-4П2 [Resin КБ-4П2] 6 400±800 То же [The same] Разделение в двухфазной системе [Interfacial separation] Хлороформ [Chloroform] 102 400±11 000 Около 3 часов [About 3 hours] Дихлорметан [Dichloromethane] 102 400±9 000 То же [The same] Толуол [Toluene] 51 200±5 300 То же [The same] Примечание. Аи/ml - арбитражная единица активности в отношении тест-штамма Listeria monocytogenes 776. [Note. AU/ml - arbitrary units of antimicrobial activity of samples per milliliter against the test strain of Listeria monocytogenes 776]. При применении метода сорбции-десорбции в качестве носителей использованы: силикагель 100/250 мкм (Lachema, Чехия), окись алюминия для хроматографии 5/40 мкм (Lachema, Чехия), аэросил (диоксид кремния) марки А300 (Калушский ОЭЗ, Украина) и карбоксильный катионит (ионообменная смола) КБ-4П-2 (ГОСТ 20298-74). Указанные носители использовали в колоночном и «ванночном» (bath) вариантах. В первом исполнении сорбенты засыпали на 1/3 объема в стеклянные колонки (300x20 мм), во втором - в колбы на 750 мл. Подготовка сорбентов заключалась в промывке водой и уравновешивании ацетатным буфером (рН = 4,6). Посадка образцов BLIS-содержащей жидкости заключалась в постепенном ее прибавлении в колонки или колбы с подготовленными сорбентами. При bath-методе колбы с ее содержимым помещали на качалку и перемешивали (60 об/мин) в течение 68 ч. Съем BLIS осуществляли в такой последовательности: дистиллированная вода (рН = 7,2), ацетатный буфер (рН = 4,7), дистиллированная вода (рН = 7,2), 5-, 10-, 20-, 30- и 35%-ные растворы ацетонитрила, дистиллированная вода (рН = 7,2). Образцы элюатов далее концентрировали методом упаривания (в 10 раз) и тестировали на активность. Установлено, что лучшие результаты по выходу антимикробной субстанции получались при использовании силикагеля и аэросила, худшие - на ионообменной смоле КБ-4П2 (см. табл. 4). В целом более удобным оказался колоночный вариант с применением силикагеля. При отработке метода фазовой сепарации в качестве нерастворимого в воде органического растворителя применяли ди- и трихлорметан (хлороформ), толуол. Чистый стеклянный или фарфоровый стакан на 1/3 объема заполняли образцом бесклеточного супернатанта, туда же вносили (1:1) растворитель. Содержимое стакана гомогенизировали с помощью механического смесителя с металлической мешалкой (800 об/мин, 10 мин). Полученную эмульсию разливали в металлические стаканы, устанавливали в ба-кет-ротор (4х150) центрифуги К-23Д фирмы «MLM» (ГДР) и откручивали в течение 20-25 мин при 5000 об/мин, 4-6°С. В результате гравитационного разделения эмульсии на границе фаз образовывался хорошо заметный интерфазный слой пленки (ИФС), содержащий концентрат бактериоцина с остатками среды роста. Разделенные фазы со стаканов осторожно удаляли с помощью вакуумного насоса Комовского, а остающийся ИФС высушивали при 90°С до постоянного веса, что обеспечивало удаление из нее органического растворителя. Установлено, что в результате фазовой сепарации уходит более 98% балласта, представляющего собой компоненты питательной среды, минеральные соли и метаболиты (табл. 5). Дихлорметан (ДХМ) предпочтительнее других растворителей из-за его более низкой температуры кипения (40°С), меньшим по сравнению с хлороформом и толуолом уровнем токсичности, легкости удаления из жидкостей и большей возможности многократного использования. При этом подсчитано, что выход BLIS по активному началу с использованием ДХМ составлял около 95% от исходного уровня и на весь процесс получения уходит не более 3 ч (см. табл. 4). При извлечении BLIS жидкофазным разделением суперна-тантов мы исходили из ранее полученных нами данных на других продуцентах о достаточно высокой эффективности данного метода [23]. Несмотря на то, что полученный указанным способом сухой концентрат BLIS содержал более 91% действующего начала (табл. 6), для изучения его природы все же требовалась его доочистка. Т а б л и ц а 5 [T a b l e 5] Выделение бактерицидного комплекса Enterococcus mundtii PPHS-5/13 из супернатанта с использованием органического растворителя [The excretion of bactericidal complex Enterococcus mundtii PPHS-5/13 from supernatant using organic solvent] Фракции супернатанта [Supernatant fractions] Сухой остаток [Dry residue], % Антилистериозная активность [Antilisterial activity], % Верхняя [Upper] 86,5±2,4 7,7±0,3 Промежуточная [Intermediate] 11,8±0,5 91,2±3,3 Нижняя [Lower] 1,7±0,06 1,1±0,02 Супернатант до обработки [Supernatant before treatment] 100 100 Т а б л и ц а 6 [T a b l e 6] Влияние протеолитических ферментов, рН и высоких температур на активность BLIS PPHS-5/13 [The influence of proteolytic enzymes, pH and high temperatures on the activity of BLIS PPHS-5/13] Ферменты, температура и рН [Enzymes, temperature and рН] Антимикробная активность [Antimicrobial activity] BLIS без обработки [BLIS without treatment], рН = 6,1 + BLIS + химотрипсин [BLIS + chymotrypsin], рН = 6,3 - BLIS + протеиназа K [BLIS + proteinase K], рН = 6,2 - BLIS при 100°С, 20 мин [BLIS at 100°С, 20 min], рН = 2* + BLIS при 121°С, 20 мин [BLIS at 121°С, 20 min], рН = 6,2 + BLIS при 121°С, 20 мин [BLIS at 121°С, 20 min], рН = 10* - Примечания. Концентрации ферментов 10 мг/мл; «+» - наличие, «-» - отсутствие активности; * перед определением активности рН образцов доводили до 6,0-6,3 ед. [Note: the concentration of enzymes - 10mg/ml; "+" available activity, "-" lack of activity; * before the determination of the activity pH of the samples was brought to 6,0-6,3 units]. Следующий и завершающий этап работы - изучение природы бактерио-цидной субстанции E. mundtii PPHS-5/13. Для выбора подходящего метода очистку BLIS проводили тремя способами: переводом осадка вещества с одного растворителя в другой (этанол, изопропанол, вода) с последующим их выпариванием, с применением C-18 колонки (Varian, Harbor City, CA), эквилибрированной метанолом и водой, и гель-фильтрацией. Для проведения гель-фильтрации пробы растворяли в фосфатном буфере и пропускали через колонку Luna 5u C18(2) 100A 250^4,6 mm (Phenomenex) жидкостного хроматографа Acta Purifier 10 (GE HealthCare, США). Для дальнейшей работы выбран метод гель-фильтрации как более производительный и воспроизводимый. Далее очищенные образцы BLIS исследовали на устойчивость к действию ферментов, рН, температуре с последующим тестированием проб на антимикробную активность. Доказательствами пептидной природы BLIS E. mundtii PPHS-5/13 послужили экспериментальные данные по ее разрушению протеолитиче-скими ферментами, что проявилось в потере антимикробного действия, а также наличие индивидуальной полосы активного пептида с молекулярным весом 5-6 кДа при электрофорезе в системе трицин-SDS-PAG (табл. 6, рис. 2). Дорожки 1 2 3 Рис. 2. Электрофорез образцов BLIS Enterococcus mundtii 5/13. Дорожки: 1 и 3 - образцы BLIS, 2 - белковые маркеры молекулярных весов [Fig. 2. Electrophoresis of BLIS Enterococcus mundtii 5/13 samples. On the ordinate axis - molecular weight (in kiloDaltons); on the abscissa axis - lanes: 1 and 3 samples BLIS, 2 - protein molecular weight markers] Масс-спектрометрический анализ образца BLIS PPHS-5/13 по результатам MALDI-TOF показал преимущественное содержание в нем вещества с молекулярной массой 5,762 кДа (рис. 3). Рис. 3. Определение молекулярного веса образца BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 по MALDI-TOF Bruker Daltonics. MALDI (лазерная десорбция и ионизация из матрицы) - TOF (времяпролетный масс-спектрометр). Анализ выполнен в отделе иммунобиохимии ГНЦ ПМБ к.ф-м.н. А.К. Суриным [Fig. 3. Determination of molecular weight of BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 sample by MALDI-TOF Bruker Daltonics. The analysis was carried out by AK Surin (State Research Center for Applied Microbiology& Biotechnology)] В завершении работы проведена оценка возможности практического использования BLIS E. mundtii PPHS-5/13. Мясо животных является чрезвычайно благоприятной средой для размножения различных групп микроорганизмов, становясь источником инфекционного заражения человека. В нашем исследовании объектом изучения степени деконтаминирующего действия BLIS PPHS-5/13 куриная кожа, снятая с охлажденного окорочка бройлера. Как показали результаты проведенных испытаний, обработка кожи бройлеров жидким препаратом BLIS E. mundtii PPHS-5/13 в дозе 100 мкл/про-бу приводила к трехкратному снижению показателя обсемененности ее поверхности сальмонеллами и листериями (табл. 7). Таким образом, в результате выполненных исследований подобрана питательная среда и условия культивирования штамма E. mundtii PPHS-5/13 для выработки практически значимых количеств бактериоциноподобной ингибирующей субстанции, определена кинетика накопления, выбран способ выделения из культуральной жидкости и показан практический пример ее возможного использования, а также получены доказательства пептидной природы активного начала. Т а б л и ц а 7 [T a b l e 7] Действие BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 на уровень обсемененности кожи бройлера сальмонеллами и листериями [Action of BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 on the broiler skin contamination level by Salmonella and Listeria] Образцы исследуемой кожи бройлерной птицы [Investigated skin samples] Содержание бактерий в смывах, КОЕ/мл [Bacterial content in wash-offs, CFU/ml] Уровень обсемененности [Level of contamination] Нативный (негативный контроль) [Native (negative control)] 349±117x103 Принят за 0% Инфицированная без обработки BLIS (позитивный контроль) [Artificially contaminated with no treatment by BLIS (positive control)] 2330±768x103 100% Инфицированная, обработанная BLIS (опыт) [Artificially contaminated after treatment by BLIS (experiment)] 690±214x103 29,6% [Note. The level of microbial contamination of sample skin after treatment of the BLIS, expressed as a percentage relative to the untreated skin0. В частности, показано, что культивирование штамма для получения бак-териоцидного комплекса следует проводить в бульоне, содержащем (г/л): гидролизат казеина - 9; сахарозу - 20; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 3; MgSO4 - 0,5 при рН = 6,0±0,2 и температуре 33...34°С в течение 12-14 ч. Такие условия выращивания обеспечивают накопление в культуральной жидкости BLIS с активностью не менее 12800 АИ/мл, что делает исследуемый микроорганизм технологически перспективным в качестве продуцента нового антибактериального средства из группы бактериоцинов. На основе сравнительных исследований по выбору способа выделения BLIS отдано предпочтение методу межфазного разделения бесклеточного ферментата при использовании дихлорметана в качестве неполярного растворителя. Применение дихлорметана предоставляло возможность многократного его использования в связи с низкой температурой кипения (40°С), минимальной токсичностью и весьма высоким выходом (до 91%) целевой фракции. Теоретической предпосылкой выбора метода межфазного разделения для жидкостной преципитации BLIS и бактериоцинов явились их амфи-фильные свойства [24]. Доказательствами пептидной природы BLIS E. mundtii PPHS-5/13 послужили экспериментальные данные по ее разрушению протеолитически-ми ферментами, выявление при помощи Tricine-SDS-PAGE индивидуальной полосы с молекулярным весом около 5-6 кДа, близкому к энтероцинам группы А [17], выделение активной фракции, имеющей по данным MALDI-TOF преимущественно вещество с молекулярной массой 5,762 кДа. Сделан вывод о том, что антимикробный комплекс пептидной природы E. mundtii PPHS-5/13 близок к бактериоцинам подкласса Па, которым свойственна высокая активность против микроорганизмов группы Listeria sp. [25, 26]. Заключение Обнаружена способность штамма Enterococcus mundtii PPHS-5/13 производить BLIS на простых по составу средах при обычных условиях аэробного роста, а также определены основные условия ее извлечения из ферментата и очистки малозатратными методами. Установлено, что выходы антимикробного вещества из бесклеточного супернатанта PPHS-5/13 с использованием метода межфазного разделения с дихлорметаном в 2-8 раза выше, чем методов солевой преципитации сульфатом аммония или адсорбции на твердых носителях, при одновременном сокращении времени выделения с 24 до 3 ч. Показано, что антимикробный комплекс Enterococcus mundtii PPHS-5/13 имеет пептидную природу, состоит преимущественно из вещества с молекулярной массой 5,762 кДа и по своим основным свойствам близок к бактериоцинам подкласса Па. На примере обработки кожи бройлерной птицы продемонстрирована возможность практического применения BLIS Enterococcus mundtii PPHS-5/13 как средства для контроля уровня микробной обсемененности некоторых продуктов питания.

Скачать электронную версию публикации