Evaluation of polymer-based fluorescent dyes for fish tagging.pdf Введение Мечение рыб существенно расширяет возможности их исследования в естественной среде обитания, позволяя изучать множество индивидуальных и популяционных показателей, таких как оценка численности стада, установление миграционных путей, определение интенсивности промысла и т.д. Несмотря на внедрение в арсенал ихтиологов разнообразных высокотехнологичных типов меток [1, 2], до сих пор остаются востребованными и традиционные методы мечения рыб, обычно более бюджетные и дающие возможность распознавания помеченной рыбы без специального оборудования. Современной альтернативой классическим внешним меткам (например, биркам) служат флуоресцентные химические красители, наносимые поверхностно или впрыскиваемые под кожу. Метод удобен для массового ме-чения мелких животных и считается относительно недорогим и безопасным для рыб. Лидером и практически единственным производителем флуоресцентных меток является фирма Northwest Marine Technology (NMT, USA), эффективность продуктов которой подтверждена многими исследованиями [3-5]. Помимо этого, существует ряд публикаций, где исследователи проводят тестирование самых разнообразных потребительских красителей, призванных еще более уменьшить себестоимость готовых меток [6-8]. Несмотря на довольно успешные, хотя и часто противоречивые результаты этих работ, русскоязычные публикации, посвященные методикам или результатам применения флуоресцентных меток, практически отсутствуют. Цель настоящего исследования - оценка мечения мелких рыб тремя видами доступных полимеров, являющихся основой для флуоресцентного пигмента. Материалы и методики исследования Для проведения мечения использовали особей пескаря сибирского Gobio cynocephalus Dybowski, 1869. Данный вид является фоновым для территории Красноярского края, массово встречается в местных водотоках и относительно легко содержится в искусственных условиях. Отлов рыб проводили с мая по октябрь 2013 г. в водотоках Красноярского края (р. Кача, р. Бугач) неводом с диаметром ячеи 10 мм. Размеры отловленных рыб варьировали от 7 до 14 см, в среднем около 10 см. Период акклиматизации рыб длился не менее 10 дней. Акклиматизация заключалась в формировании стабильной однородной выборки рыб, адаптированной к лабораторной температуре, свету, режиму и типу кормления. В процессе подготовки рыб к эксперименту удаляли эктопаразитов (паразитических ракообразных рода Lernaea); рыб, имеющих поверхностные язвы, дополнительно пролечивали стандартными методами [9]. Оборудование для содержания рыб до и после проведения мечения представлено ёмкостями из пищевого алюминия объёмом около 500 л (30^130x130 см). Резервуары оборудованы системами фильтрации, аэрации воды и подсветки (лампы мощностью 50 Вт). Режим освещения (10 свет / 14 темнота) задавался таймером. Температура воды поддерживалась на уровне 19-20°С. Кислородное насыщение при данной температуре - 100%. Два раза в неделю в резервуарах чистили и меняли 1/10 часть объема воды. При кормлении рыб использовали сухой форелевый гранулированный комбикорм и замороженный комбикорм собственного изготовления. Режим кормления сухим комбикормом - 4 г на 15 рыб один раз в два дня; замороженным комбикормом - 15 г на 15 рыб один раз в два дня. Для снижения стрессового фактора при пересаживаниях, взвешивании и мечении, рыб предварительно усыпляли раствором анестетика (в том числе рыб в контрольной группе). Для этих целей использовали природный анестетик - гвоздичное масло - согласно рекомендациям [10, 11]. Для мечения рыб применяли инсулиновые шприцы с иглой (1 мл, 0,45 мм*12 мм). Время мечения одной усыпленной рыбы составляло примерно 15-30 с. Метка вводилась подкожно в область основания грудных плавников. Непосредственно после процедуры мечения рыб помещали в ёмкость с раствором перманганата калия (0,01 г на 1 л воды) на 10-15 мин для снижения вероятности возникновения воспалений септической природы и другого типа поражений патогенными для рыб организмами. Взвешивание каждой группы рыб (контрольной и экспериментальной) проводили в водной среде. Для этого на электронных весах (с точностью измерения до 0,01 г) обнулялась масса стеклянной ёмкости с объемом воды около 1 л, затем туда высаживали рыб и проводили взвешивание. В ходе работы мы тестировали три типа меток, составляющими которых являлись следующие компоненты: 1. Акриловая флуоресцентная краска на основе водной акриловой дисперсии (производитель ЗАО Завод художественных красок «Невская Палитра», г. Санкт-Петербург). 2. Кремнийорганическая паста-основа «Пентэласт-712» марка А + флуоресцентный пигмент (страна-производитель - Индия, импортёр - ООО «Люминофор Сити», г. Пермь) + сшивающий агент (производитель ООО «Пента-91», г. Москва). Соотношение компонентов по массе - 100:1:6. При температуре 20°С полученная смесь застывает в течение 72 ч. 3. Кремнийорганическая паста-основа «Пентэласт-750 FF» + флуоресцентный пигмент (страна-производитель - Индия, импортёр - ООО «Люминофор Сити», г. Пермь) + сшивающий агент (производитель ООО «Пента-91», г. Москва). Соотношение компонентов по массе - 95:1:6. При температуре 20°С полученная смесь застывает в течение 30 мин. Каждым типом помечались 15 экземпляров пескаря (всего 45), контрольная (немеченая) группа также состояла из 15 особей. Максимальная продолжительность эксперимента с контрольной группой составила 134 дня, после чего рыбы с сохранившимися метками выдерживались еще 6 месяцев. Для оценки эффективности мечения определяли следующие параметры: 1) показатель смертности - отношение числа погибших особей к общему числу рыб, выраженное в процентах; 2) относительный прирост массы тела особи (W - W0) 100 W = ' 0 х-, отн W0 n где W - относительный прирост массы на одну особь, %; W - масса выборки рыб на дату i, г; W0 - масса выборки рыб в начале эксперимента, г; n - количество рыб в выборке (при отсутствии смертности рыб в эксперименте), шт.; 3) показатель потери меток - отношение числа рыб без метки к общему числу помеченных рыб, выраженное в процентах; 4) время сохранности метки - время, в течение которого метка остаётся распознаваемой; 5) распознаваемость метки - определялась видимость метки в воздушной среде, отдельно при лабораторном и ультрафиолетовом освещении. Показатель оценивался по четырёхбалльной системе: 0 - метки нет, 1 - метка едва заметна, 2 - метка хорошо распознаётся, но её состояние отлично от первоначального, 3 - метка хорошо видна; 6) локальное состояние - степень воздействия метки на организм рыбы в области прикрепления метки. Показатель оценивался по четырёхбалльной системе: 0 - полное заживление (шрама не видно), 1 - есть рана, но нет покраснения, 2 - небольшое воспаление (небольшое покраснение в месте введения метки), 3 - сильное воспаление (отчётливое покраснение в районе метки). В качестве источника ультрафиолетового излучения (УФ), необходимого для возбуждения флуоресценции, использовали УФ-фонарь на 12 светодио-дах с пиковой длиной волны 395 нм. Результаты исследования и обсуждение Имплантация рыбам всех видов полимеров приводила к формированию четкой метки в основании грудного плавника, которая хорошо распознавалась как при лабораторном, так и при УФ-освещении (рис. 1). Акриловая метка образовывала широкую (диаметром 0,5-0,7) цветную область, в то время как силиконовые метки формировали в тканях более компактную структуру (менее 0,5 см). Рис. 1. Пескари, меченные акриловыми флуоресцентными красителями синего цвета. А - лабораторное освещение, В - ультрафиолетовое освещение (фото И.В. Зуева) [Fig. 1. Gudgeons, tagged with blue-fluorescent dye. A - laboratory light, В - UV light (Photo IV Zuev)] Выживаемость рыб в результате мечения и дальнейшего выдерживания составила 100% во всех вариантах опыта и в контроле (таблица). Осмотр, проведенный через 16 сут после начала эксперимента, показал, что в варианте с акриловыми метками у 73% особей наблюдалось полное заживление места инъекции, у остальных особей отмечались воспаления разной степени тяжести, соответствующие 2 и 3 баллам. В варианте с силиконовыми метками на 16-е сут доля особей с воспалениями ткани в районе метки выше (около 40%). Однако на 44-е сут эксперимента полное заживление места внедрения метки диагностировали во всех вариантах опыта. Показатели смертности рыб (d, %) и потери меток разных типов (l, %) [Fish mortality (d, %) and the loss of tags of different types (l, %)] Время, дни [Time, days] Контроль [Control] Акрилат [Acrylate] «Пентэласт-712» [Pentelast-712] «Пентэласт-750ЕЕ» [Pentelast-750FF] d, % d, % l, % d, % l, % d, % l, % 1 0 0 0 0 0 0 0 16 0 0 0 0 46,6 0 80,0 44 0 0 0 0 93,3 0 86,6 74 0 0 0 - - - - 103 0 0 0 - - - - 134 0 0 0 - - - - Примечание. «-» - эксперимент прекращен. [Note. «-» - experiment terminated]. Метки на акриловой и силиконовой основе существенно различались по степени сохранности в процессе тестирования. За весь 134-дневный период ни одной акриловой метки не было утрачено, в то время как значительная потеря силиконовых меток была отмечена уже на 16-й день, а к 44-му дню метку сохранила только одна рыба в варианте с «Пентаэласт-712» и две рыбы - «Пентаэласт-750FF» (см. таблицу). Эксперимент с силиконовыми метками после этого был прекращен, однако рыбы, имевшие метки на 44-й день, сохранили их в неизменном виде и после 6 мес культивирования. Деградация акриловых меток происходила постепенно. К концу 134-дневного периода хорошо распознавалось более 70% меток при лабораторном освещении и более 90% при освещении УФ (рис. 2). Воздействие имплантации акриловой метки не оказывает существенного воздействия на ростовые показатели рыб. Больший относительный прирост массы у контрольной группы в сравнении с опытной регистрировался в начале и середине эксперимента, на 134-е сут больший прирост, напротив, был отмечен для опытной группы. Средние за весь период значения прироста массы тела между двумя группами статистически значимо не различались (р > 0,05) (рис. 3). 44 сутки 74 сутки 103 134 16 сутки 44 сутки 74 сутки 103 134 [Time days] сутки сутки [Tim e, days] сутки сутки Лабораторное освещение [Laboratory light] □Метка хорошо видка DMeraa распознаваема [Tag clearly seen] [Tag is identifiable] Уф-освещение [uv light] П Метка едва заметна ■ Метки нет [Tag is barely seen] [No tag] Рис. 2. Распознаваемость акриловых меток при лабораторном и УФ-освещении [Fig. 2. Identifiability of acrylic tags at the laboratory and UV light] [Average] ■ Эксперимент ■ Контроль Время, сутки [Time, days] Рис. 3. Относительные приросты рыб в эксперименте с акриловыми метками и в контроле. Планки погрешностей представлены в виде стандартной ошибки среднего [Fig. 3. Relative fish increase in the experiment with acrylic tags and in control. Error bars are presented as a standard error of the mean] Результаты проведенных экспериментов говорят о возможности использования относительно экономически доступных веществ (полимеры, пигменты) в качестве меток для рыб. Стоимость минимального тестового комплекта оригинальных полимерных меток (VIE tags) фирмы NMT составляет около $42 за 1 мл (при среднем расходе 300-500 меток на 1 мл) [12]. При этом доставка комплекта до России через сторонние организации (NMT не имеет представительства в России) может увеличить стоимость в 3-5 раз. Компоненты меток, используемые в настоящем исследовании, имеют значительно меньшую стоимость: акриловый флуоресцентный краситель -60 руб./50 мл, «Пентэласт-712» - 405 руб./кг, «Пентэласт-750FF» - 680 руб./кг, флуоресцентный пигмент - 120 руб./10 г. 60% 40% 20% 0% 100% По составу и структуре к VIE tags наиболее близки силиконовые компаунды серии «Пентаэласт», застывающие после инъекции. Относительно неудачные результаты с сохранностью меток данного типа можно объяснить высокой плотностью компаундов после отверждения. Активно работающие мышцы грудного плавника выталкивали застывшие шарики полимера вскоре после мечения. Если этого не происходило, метка сохранялась долгое время (до 6 мес) без какой-либо деградации. J.L. Frederick [3], тестировавший сходные по поведению VIE tags на мелких рыбах (до 8 мм), отмечал, что застывание эластомера в тканях происходит только в течение 24 ч после инъекции и сохранность метки в этот период напрямую зависит от активности рыбы. Сохранность VIE tags при мечении осетровых зависела от места прикрепления метки и была выше при мечении в хрящевую ткань рыла, в то время как при мечении межлучевого пространства грудных плавников потеря составила 8% на 150-е сут [4]. В отличие от компаундов, имплантированные в ткань акриловые метки представляют собой достаточно пластичную массу, вследствие чего не выталкиваются мышечными тканями рыб. Весь объем полимера относительно однородно распределяется под кожными покровами. Вместе с тем метки данного типа непригодны для длительного использования, поскольку с течением времени уменьшаются в размерах до полного исчезновения. Согласно нашим экспериментам распознавание акриловых меток у мелких рыб (около 10 см) возможно до 4 мес, более крупным рыбам можно имплантировать больший объем полимера, что увеличивает срок службы метки. Сохранность акриловых меток в работах американских исследователей [6, 7] составляла от 2-4 до 12-16 мес и зависела от объема метки и её локализации. В целом анализ работ, где тестируются различные варианты данного типа меток для рыб, говорит о том, что эффективность мечения во многом определяется такими факторами, как опыт оператора, размер рыбы, локализация метки, выдерживание после мечения и т.д. [6, 13, 14]. При аккуратной имплантации большинство меток остаются видимыми не менее 2-3 мес и не оказывают воздействия на ростовые показатели рыб. Заключение Таким образом, акриловые флуоресцентные красители и затвердевающие силиконовые полимеры могут быть использованы в качестве аналогов популярным торговым продуктам фирмы NMT. Областью применения акри-латов может быть мечение мелких рыб с их контролем в течение 2-3 мес. Процедура имплантации акрилатов относительно дешева и проста, а разнообразие цветовой палитры позволяет присваивать рыбам индивидуальный код. Протестированные силиконовые метки могут быть эффективными для рыб средних размеров (более 15 см) или при их подкожной имплантации в относительно пассивной области.

Скачать электронную версию публикации