Oligonucleotide inhibitors of Dnmt1: penetration and Hela and Caski cells growth inhibition.pdf Введение Метилирование цитозина в составе CpG островков генома является необходимым инструментом регулирования активности генов, родительского импринтинга, инактивации Х-хромосомы, поддержания целостности генома клетки и его защиты от встраивания ретровирусов и транспозонов [1]. В клетках млекопитающих важную роль в этом процессе играют ДНК-метилтрансферазы (ДНК МТазы) Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b. При этом Dnmt3a и Dnmt3b отвечают за метилирование denovo, а Dnmt1 - за восстановление профиля метилирования в дочерней цепи во время репликации ДНК [2]. Известно, что одним из ключевых факторов запуска и развития процесса канцерогенеза является локальное гиперметилирование CpG-островков в регуляторных областях (район промотора и первого экзона) генов-онко-супрессоров [3]. Аберрантное метилирование регуляторных областей ге-нов-онкосупрессоров показано для подавляющего большинства известных спорадических онкопатологий и происходит на самых ранних стадиях заболевания до проявления клинических признаков [4]. Кроме того, показано, что набор метилированных CpG-островков (профиль метилирования ряда генов-онкосупрессоров) может специфически характеризовать определенный тип опухоли и различается для разных онкопатологий [5]. Поскольку присоединение метильной группы к цитозину в составе ДНК не приводит к изменению генетического кода, использование ингибиторов МТаз позволяет добиться реактивации генов-онкосупрессоров, приводящей к обратному развитию опухоли [2]. В настоящее время допущены к применению аналоги цитидина (Vidaza®, Dacogen®) для терапии острого миело-идного лейкоза и миелодиспластического синдрома [6]. Однако помимо высокой эффективности данные препараты обладают сильным токсическим и мутагенным эффектом. Таким образом, остается актуальным поиск прямых ингибиторов МТаз, обладающих наряду с противоопухолевой активностью умеренным воздействием на нормальные клетки. Ранее нами сконструированы и синтезированы конкурентные олигоде-зоксирибонуклеотидные ингибиторы (ОДН) Dnmt1 человека как наиболее близкие к природному субстрату фермента - клеточной ДНК - и продемонстрирована их способность ингибировать реакцию метилирования ДНК in vitro [7]. Таким образом, цель данной работы - изучение влияния лучших олигонуклеотидных ингибиторов Dnmt1 на рост клеток карциномы шейки матки Hela и Caski. Материалы и методики исследования Клеточные линии. Для экспериментов использовали клеточные линии HeLa (карцинома шейки матки, ассоциированная с ВПЧ-18), CaSki (карцинома шейки матки, ассоциированная с ВПЧ-16) и L-68 (легочные фибробла-сты эмбриона человека) из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия), посевная концентрация 105 клеток/мл. Использовалась среда Игла МЕМ производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Россия) с добавлением 5%-ной фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Изучение внутриклеточной локализации ОДН в клетках. Для изучения внутриклеточной локализации ОДН в клетках HeLa и CaSki использовали флуоресцентно меченные структуры. Клетки культивировали в 6-луночных планшетах на покровных стеклах в 2 мл среды с сывороткой без антибиотиков (18 ч, 37°С, 5% СО2), затем ее заменяли на среду без сыворотки и антибиотиков. Доставку ОДН в клетки осуществляли с помощью трансфекционного агента Липофектамин 2000 «Invitrogen» (США) согласно инструкции производителя. Для этого преинкубированные смеси липофектамина и ОДН разводили средой Игла МЕМ, вносили по 100 мкл в лунки планшета и культивировали клетки в течение 4 ч. Количество ОДН подбирали согласно условиям эксперимента. Затем среду заменяли обычной ростовой с ампициллином и культивировали еще 24-72 ч, после чего стекла с клетками помещали на 10 мин в 4%-ный раствор формалина для фиксации, трижды отмывали в однократном фосфатном буфере (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4х2H2O, 2 мМ KH2PO4, pH = 7,4). Далее вносили по 1 мкл 1000-кратного раствора DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) «Invitrogen» (США) на 15 мин для окрашивания ядер и вновь трижды отмывали в фосфатном буфере. После этого проводили микроскопию образцов на люминесцентно-инверсионном микроскопе СКХ41 «Olympus» (Япония). При микроскопии делали отдельно снимки ядер клеток (DAPI, синее свечение) и метки на олигонуклеотидах (FAM, зеленое свечение), затем при помощи компьютерной обработки фотографии совмещали и оценивали распределение меченых ОДН в клетке. Исследование цитотоксичности и ингибирующей активности ОДН. Монослой культуры клеток L-68, HeLa и CaSki выращивали в лунках плоскодонных 96-луночных планшетов. Экспозиция ингибиторов составляла 4 ч, после чего клетки культивировали в течение 24 ч. Затем среду удаляли, а монослой прокрашивали витальным красителем нейтральным красным. После удаления красителя и отмывки лунок добавляли лизирующий буфер. Количество красителя, адсорбированного живыми клетками монослоя, измеряли на планшетном спектрофотометре Emax «MolecularDevices» (США) на длине волны 540 нм. В качестве контролей использовали лунки планшета, в которые препараты не вносили, а также лунки без ингибиторов, но с добавлением липофектамина. Зависимости количества живых клеток (A) от концентрации ингибиторов (I) анализировали с помощью программы для нелинейного регрессионного анализа Origin 8.0 «OriginLab» (США), значения 50%-ных цитотоксических концентраций (TC50) препаратов рассчитывали по формуле 50 A A = - ' [I] Y ' 1 + TC 50 У где n - коэффициент Хилла. Статистическую обработку полученных результатов проводили по U-критерию Манна-Уитни. Олигодезоксирибонуклеотидные ингибиторы. ОДН синтезированы ЗАО «Биосан» (Новосибирск). При получении фосфотиоатов на стадии окисления использовали реактив Beaucage «GlenResearch» (США) как сульфирующий агент. Шпилечные ДНК-структуры получали отжигом олигону-клеотидов - нагревом до 85°C с последующим плавным охлаждением до комнатной температуры. Результаты исследования и обсуждение Локализация ОДН в клетках карцином шейки матки. Для исследования способности ОДН проникать в клетки HeLa и CaSki и сохраняться в них длительное время синтезированы меченные FAM олигонуклеотиды ОДН-^ (FAM-GAAATGGATCСGCTCTAAACTGCCСGCC) и ОДН-2Р (FAM-GAAA TGGATCСGCTCTAAACTGCCCCCCCAGTTTAGAGCGGATCCATTTC), в которых все фосфаты заменены фосфотиоатами. На рис. 1 приведены фотографии флуоресценции ОДН-^ в клетках HeLa после экспозиции 100 нМ олигонуклеотида. Использование 0,3H-2F вместо ОДН-Щ а также снижение концентрации препарата в среде, вплоть до 10 нМ, не приводило к значительному изменению картины флуоресценции. Аналогичная картина наблюдалась и на клетках CaSki для обеих исследованных структур. Рис. 1. Оценка проникновения и преимущественной локализации олигонуклеотида ОДН-iF в клетках HeLa: А - флуоресценция ОДН; B - то же, но с наложением свечения ядер клеток, окрашенных DAPI [Fig. 1. The oligonucleotide localization in HeLa cells. A - fluorescence of oligonucleotide, B - the same with DAPI stained nuclei fluorescence overlay] Анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что условия эксперимента обеспечивают эффективную доставку синтетических структур в клетки. При этом интенсивность флуоресценции (а следовательно, и концентрация ОДН) в подавляющем большинстве (до 90-100%) клеточных ядер практически одинакова. Следовательно, трансфецированные ОДН локализуются непосредственно там, где происходит реакция метилирования ДНК. При изучении деградации олигонуклеотида ОДН-^ в клетках HeLa в течение 72 ч выявлено постепенное снижение интенсивности свечения в цитоплазме с первого дня эксперимента, тогда как флуоресценция в клеточных ядрах начинала снижаться только после трех дней культивации (рис. 2; для 0ДН-2F получены аналогичные результаты). В клетках CaSki оба оли-гонуклеотида продемонстрировали схожие результаты, однако окрашивание ядер на третий день интенсивнее, чем в клетках HeLa.3TO можно объяснить расходованием ОДН в результате деления клеток, а различия во флуоресценции на третий день являются следствием неодинакового темпа клеточных делений, что подтверждается литературными данными [8]. Таким образом, Рис. 2. Устойчивость ОДН-IF в клетках HeLa (A - 24 ч, B - 48 ч, C - 72 ч) [Fig. 2. The oligonucleotide stability in HeLa cells over time. A - 24 hours, B - 48 hours, C - 72 hours] Оценка цитотоксичности олигонуклеотидных ингибиторов Dnmtl. можно предполагать, что в суточных экспериментах с немечеными ОДН не происходит значимой деградации ингибитора в клетках. Проведены эксперименты по изучению влияния различных концентраций ОДН в среде (от 1,25 до 1280 нМ) на жизнеспособность клеток HeLa, CaSki и L-68. Значения 50%-ных токсических концентраций (TC50) приведены в таблице. Оценка цитотоксического действия олигонуклеотидных ингибиторов Dnmt1 в отношении клеточных линий HeLa, CaSki и L-68 [Cytotoxicity of the oligonucleotide Dnmt1 inhibitors measured on HeLa, CaSki and L-68 cells] Лиганд Структура (5'^3') TC^ нМ [Ligand] [Structure (5'^3')] HeLa CaSki L-68 ОДН-К GAAATGGATCATCTCTAAACTG >104 >104 >104 ОДН-1 GAAATGGATCMGCTCTAAACTGCCMGCC 285±15* 147±5* >104 ОДН-2 GAATGGATCMGCTCTAACTGCC cttacctaggcgagattgaccc 408±9* 170±5* >104 ОДН-3 GAATGGATCCGCTCTAACTGCp cttacctagamgagattgaccc 236±10* 118±3* >104 ОДН-4 gaatggatcmactctaactgcc CTTACCTAGGCGAGATTGACCC 290±18* 136±5* >104 Примечание. M - 5-метилцитозин. Жирным шрифтом выделены нативные либо модифицированные участки 5'-CG. * p < 0,01. [Note. M - 5-methylcytosine. Native or modified Dnmtl sites 5'-CG are in bold. * p < 0.01]. Для исследованных синтетических ингибиторов получены весьма низкие значения TC50 в отношении раковых клеток (118-408 нМ, см. таблицу), в то время как для здоровых фибробластов TC50 оказалась на уровне контроля (>104 нМ). Различие с контролем более чем в 100 раз указывает на неплохой терапевтический потенциал сконструированных олигонуклеотидов. Наиболее эффективным оказался ОДН-3 (TC50HeLa = 236 нМ, TC50CaSki = 118 нМ, см. таблицу), содержащий полуметилированный сайт с C:A некомплемен-тарностью. Максимальная ингибирующая активность ОДН-3 может быть обусловлена наиболее выгодным пространственным расположением шпилечной структуры относительно фермента. Dnmt1 является высокопроцес-сивным ферментом и характеризуется строгой направленностью перемещения (3^5) по неметилированной цепи ДНК [9-11], а в случае с ОДН-2 и ОДН-4 шпилька располагается по ходу движения Dnmt1 (см. таблицу), что, видимо, снижает эффективность взаимодействия олигонуклеотида с алло-стерическим сайтом в регуляторном домене белка. Сравнивая эффективность ингибирования роста клеток HeLa (TC50 = = 236-408 нМ) и CaSki (TC50 = 118-170 нМ), можно предположить, что выявленное различие в чувствительности клеточных линий к ОДН обусловлено неодинаковым функциональным значением аберрантного гиперметилирования ДНК для прогрессии различных типов рака шейки матки. Для исследования влияния Липофектамина 2000 на жизнеспособность клеток в ростовую среду вносили липофектамин в количествах, необходимых для транспортировки ингибиторов ОДН-1-ОДН-4, взятых в аналогичных опыту концентрациях. Полученные значения TC50 для липофектамина более чем на порядок отличались от TC50 ингибиторов, что позволило считать его вклад в цитотоксический эффект ОДН незначительным. Заключение В настоящем исследовании проведена работа по изучению влияния оли-гонуклеотидных ингибиторов Dnmt1 на рост клеток карциномы шейки матки HeLa и CaSki. Исследована их способность проникать в раковые клетки и сохраняться в них с течением времени. Оценен также токсический эффект влияния ингибиторов на здоровые фибробласты и клетки карцином HeLa и Caski. Нами показано, что замена фосфатов на фосфотиоаты способствовала длительному нахождению ингибитора в ядре клеток, а сочетание структурных особенностей, таких как C : A некомплементарность и «шпилька», имели кумулятивный эффект. Так, наилучшие показатели IC50 получены у соединений ОДН-3 и ОДН-4, которые обладают всеми перечисленными модификациями. Стоит отметить, что наличие неспаренных нуклеотидов в сайте узнавания двуцепочечной ДНК значительно усиливает способность ингибировать реакцию метилирования. В подтверждение: одноцепочечная структура ОДН-1 с двумя сайтами MG проявляет лучшую активность по сравнению со шпилечной структурой ОДН-2, содержащей сайт 5'-MG-3'/3'-GC-5'. Несмотря на то, что обе исследуемые карциномы шейки матки ассоциированы с вирусом папилломы человека (HeLa с ВПЧ-18, CaSki с ВПЧ-16), влияние ингибиторов происходит с разной эффективностью: значения TC50 для исследуемых ОДН варьировали в диапазоне 236-408 нМ -для клеточной линии HeLa и 118-170 нМ для клеточной линии CaSki. В то же время показатель TC50 для фибробластов линии L-68 превысил значение 10 мкМ для всех испытуемых ингибиторов. Подобное отличие в половинных токсических концентрациях, вкупе с преимущественным накоплением ингибитора в ядре клетки и долгим временем жизни, дает возможность (при потенциальном клиническом применении) существенно повысить дозу препарата, не опасаясь сильных токсических эффектов. Дальнейшее изучение подобного рода структур является привлекательным и перспективным с точки зрения терапии раковых заболеваний, ассоциированных аберрантным метилированием генома.

Скачать электронную версию публикации