DNA copy number variations of blood lymphocytes in people exposed to occupational irradiation as a possible marker of hi.pdf Введение При радиационном воздействии в ДНК клеток могут индуцироваться од-нонитевые разрывы (single strand breaks - SSB), двунитевые разрывы (double strand breaks - DSB) и ДНК-белковые сшивки [1, 2]. Большинство повреждений ДНК может быть быстро и эффективно восстановлено эндогенными системами репарации. Однако у некоторых индивидов наблюдаются нарушения системы репарации, которая оказывается не в состоянии обнаружить и / или эффективно репарировать нарушения ДНК, что приводит к высокой индивидуальной радиочувствительности (ИРЧ). Нерепарированные или неправильно репарированные однонитевые и двунитевые (главным образом) разрывы ДНК способствуют формированию точковых мутаций и хромосомных аберраций. Ионизирующее излучение, помимо индукции хорошо известных нестабильных хромосомных аберраций (таких, как хроматидные и хромосомные фрагменты, дицентрические, кольцевые хромосомы и др.) [3], способно вызывать образование стабильных цитогенетических аномалий: транслокаций, исследуемых при помощи метода FISH (fluorescence in situ hybridization) [4, 5], крупных делеций [6] и вариации числа копий ДНК (CNV - copy number variation), которые широко представлены в геноме и связаны с генетической изменчивостью, менделевскими заболеваниями и отчасти с мультифакториальными заболеваниями [7], тем не менее могут возникать в геноме de novo под действием радиации [8]. CNV или несбалансированные хромосомные аномалии в основном представлены делециями и микроделециями или амплификациями хромосомных локусов (структурные CNV) или отдельных хромосом (числовые CNV). Делеции и амплификации могут влиять на экспрессию генов, как правило, при делециях экспрессия генов, локализованных в делетированном регионе, снижена, при амплифи-кациях - повышена [9, 10]. Как полагают X. Li с соавт. (2012), CNV могут являться одним из наиболее вероятных альтернативных механизмов, регулирующих ИРЧ. На лейкозных клетках человека, обладающих высокой радиочувствительностью, показано, что крупные CNV располагаются в геномных регионах, которые имеют функциональное значение для реализации механизмов репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК, индуцируемых при радиационном воздействии. Авторы делают предположение о том, что коррекция уровней экспрессии генов репарации ДНК за счёт деле-ций и амплификаций оказывает влияние на уровень радиационной чувствительности [11]. Исследования CNV давно проводятся с применением методов FISH и сравнительной геномной гибридизации (CGH - comparative genomic hybridization) (очень крупные CNV протяжённостью несколько сотен Mbp), а теперь и с помощью микроматричных технологий CGH-array и SNP-array, которые позволяют определять CNV очень малых размеров - от 2-5 kbp. Исследования возникновения de novo CNV под действием радиации и других генотоксических факторов - это совершенно новая область, известно лишь несколько работ в системе in vitro. Одна из них - это последняя работа M.F. Arlt с соавт. (2014) на культуре фибробластов. Установлена дозовая зависимость индукции CNV, частота образовавшихся de novo CNV статистически значимо превышала спонтанный уровень, начиная с дозы 1,5 Гр. Средний размер индуцированных радиацией CNV составил 288 kbp (2,7 kbp к 34,2 Mbp). Радиационно-индуцированные CNV располагались по всему геному, но наибольшая их концентрация отмечалась в «горячих» точках (в которых, как правило, находятся гены-супрессоры опухолевого роста и фра-гильные участки хромосом) [8]. К сожалению, пока нет исследований индукции под действием радиации новых CNV в системе in vivo на экспериментальных животных, а также у лиц, подвергавшихся радиационному воздействию. Считается, что это технически трудно сделать в связи с низкой чувствительностью (20% му-тантной ДНК) микроматричного SNP-array анализа. Предполагается, что в крови облучённых лиц частота клеток с новыми CNV будет ничтожно мала, поэтому их не удастся детектировать. Несмотря на указанные трудности, представляющиеся совершенно обоснованными с методических позиций, нами предпринята попытка исследования индукции новых CNV в клетках белой крови у лиц, подвергавшихся долговременному профессиональному облучению. Планируя данное исследование, мы руководствовались следующими соображениями, позволяющими рассчитывать на получение обоснованных выводов: 1. Использование самых современных технологий анализа, а именно микроматрицы «CytoScan™ HD Array» («Affymetrix», США), которая обладает высокой чувствительностью (около 10% мутантной ДНК) и позволяет количественно оценивать мозаичные CNV. 2. Предполагается, что клетки с образовавшимися de novo CNV будут накапливаться (более 10%) и детектироваться, но только у индивидов, у которых есть нарушения системы репарации ДНК в клетках, иначе говоря, только у людей с высокой индивидуальной радиочувствительностью, и сама детекция образовавшихся de novo CNV в геномной ДНК крови этих индивидов будет свидетельствовать об их радиочувствительности. Материалы и методики исследования Характеристика обследованных лиц. Обследовано 46 здоровых работников мужского пола Сибирского химического комбината (СХК) - крупнейшего в мире предприятия атомной отрасли, которые в процессе профессиональной деятельности подвергались длительному радиационному воздействию (внешнему облучению). Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации 1964 г. (с изменениями 1975-2008 гг.) и с разрешения локального этического комитета Северского биофизического научного центра ФМБА России. Получены информированные согласия от всех работников СХК, участвовавших в данном исследовании. Средняя суммарная доза внешнего облучения обследованных лиц составила 281,7±38,7 мЗв, медиана - 196,4 мЗв, интерквартиль-ный размах - 160,1-288,7 мЗв, минимальная - 100,8 мЗв, максимальная - 1 379,61 мЗв. Дозы облучения работников находились в пределах плато на дозовой кривой (100-500 мЗв), когда частота цитогенетических аномалий не увеличивается с ростом дозы облучения [12]. Только трое обследованных имели суммарные дозы более 1 Зв. Данные об индивидуальных дозах у-излучения, измеренных с помощью фотоплёночных и термолюминесцентных дозиметров, получены из отдела охраны труда, ядерной и радиационной безопасности СХК (индивидуальный дозиметрический контроль персонала проводится с момента ввода в действие основных технологических процессов с 1953 г.). Средний возраст обследованных лиц составил 59,9±1,3 (минимальный - 45 лет, максимальный - 77 лет). Источником медицинской информации являлся архив Северского биофизического научного центра ФМБА России, который содержит медицинские документы всех обследованных работников СХК [12]. Объектом исследования служила периферическая кровь, которую брали из вены утром натощак в стерильные контейнеры «Vacuette» с гепарином и EDTA. Кровь с гепарином использовали для стандартного цитогенетиче-ского анализа, из крови с EDTA выделяли ДНК для последующего микроматричного анализа. Цитогенетический анализ. Для всех обследованных лиц проводили стандартный цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови. Для постановки культуры использовали цельную кровь, которую смешивали с кулкгуральной средой и инкубировали в культуральных флаконах при 37°С в суховоздушном термостате. Все процедуры проводили в стерильных условиях с использованием ламинарного шкафа. Состав среды: 85% среды RPMI 1640, 15% эмбриональной телячьей сыворотки. В бакпечатки с 8 мл среды вносили 2 мл цельной крови и 2-2,5% фитогемагглютинина («Sigma», США). После инкубации в течение 45 ч в культуры добавляли колхицин до конечной концентрации 0,06 мкг/мл и продолжали культивирование ещё 3 ч. Для получения метафаз использовали общепринятую схему обработки материала: гипотонизация с помощью 0,56%-ного раствора KCl, содержащего 0,95% цитрата натрия; фиксация смесью этанола и ледяной уксусной кислоты. Рутинную окраску хромосом проводили красителем Гимза, приготовленным на фосфатном буфере. Хромосомный анализ осуществляли с помощью микроскопа «Leica DM2500» (Германия). У каждого индивида обследовали не менее 300 метафаз. Анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования. Из аберраций хромосомного типа - парные фрагменты, точечные парные фрагменты, кольцевые и дицентрические хромосомы, число хроматидных фрагментов; учитывали также хроматидные обмены (фигуры типа «крест») и полиплоидные клетки. Количественно результаты выражали в виде частоты аберрантных клеток и всех видов хромосомных аберраций на 100 проанализированных метафаз. Выделение ДНК. ДНК из крови выделяли при помощи набора «QIAamp DNA Blood mini Kit» («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя (http://www.qiagen.com/ru/products/catalog/ sample-technologies/dna-sample-technologies/genomic-dna/qiaamp-dna-blood-mini-kit#resources). «QIAamp DNA Blood mini Kit» позволяет существенно упростить выделение ДНК из крови благодаря спин-колонкам. Концентрацию и чистоту выделения ДНК оценивали на спектрофотометре «Nano-Drop-2000» («Thermo Scientific», США). Концентрация составила от 50 до 150 нг/мкл, А260/А280 = 2,10-2,35; А260/А230 = 2,15-2,40. Целостность ДНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе «TapeStation» («Agilent Technologies», США) с использованием набора «Agilent Genomic DNA ScreenTape System Quick Guide» («Agilent Technologies», США). Фрагменты ДНК в основном имели массу более 48 kbp. Выделенная ДНК хранилась при -80°С в низкотемпературном морозильнике «Sanyo» (Япония) и использовалась для микроматричных исследований. Микроматричный анализ. Микроматричный анализ проводили на микроматрицах (ДНК-чипах) высокой плотности фирмы «Affymetrix» (США) «CytoScan™ HD Array» (http://www.affymetrix.com/esearch/search. jsp?pd=prod520004&N=4294967292). «CytoScan™ HD Array» содержит 2 млн 670 тыс. маркёров - 1 млн 900 тыс. неполиморфных маркёров и более 750 тыс. однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), позволяющих определить структурные вариации более 36 тыс. генов. Наличие полиморфных маркёров на микроматрице позволяет также определить участки с потерей гетерозиготности (loss of heterozygosity - LOH). Процедуры пробоподготов-ки, гибридизации и сканирования проводили в соответствии с протоколом производителя на системе «Affymetrix GeneChip® Scanner 3000 7G» («Affymetrix», США). Для обработки результатов микрочипирования использовали программу «Chromosome Analysis Suite 2.0» («Affymetrix», США), которая разработана специально для анализа результатов исследований на матрице «CytoScan™ HD Array». Во всех случаях показатель snpQC выше 15. При помощи программы в хромосомах определяли CNV - делеции и амплификации (Loss и Gain) размером не менее 100 kbp. Также определялись мозаичные делеции и амплификации (LossMosaic и GainMosaic). Микрочип «CytoScan™ HD Array» позволяет выявлять мозаичные мутации с чувствительностью 10% и более мутантной ДНК на фоне нормальной. В программе «Chromosome Analysis Suite 2.0» делеция представляется аллельными пиками (Allele Peaks) с двумя «полосками» на уровне 1 против 3 аллельных пиков (AA, AB, BB) в норме на уровне 2. Мозаичная делеция графически представляется 4 «полосками» (AAA, AAB, ABB, BBB) на уровне 1; мозаичная амплификация - 4 аллельными пиками на уровне 3 или 4 (полоски могут сливаться: ААА может сливаться с ААВ, а АВВ может сливаться с ВВВ, что свидетельствует о высокой представленности клона с мутацией); амплификация (Gain) представлена 2 аллельными пиками на уровне 3 или 4. Таким образом, «CytoScan™ HD Array» может использоваться для того, чтобы точно определить число копий всех хромосомных локусов от 0 до 4 в диплоидных клетках человека. Статистические методы. Для выборок вычислялись M - среднее арифметическое, SE - стандартная ошибка и SD - среднее квадратичное отклонение. Для сравнения групп использовали непараметрический критерий Вил-коксона - Манна - Уитни с использованием пакета прикладных программ StatSoft STATISTICA 8.0 for Windows. Результаты исследования и обсуждение Трудности интерпретации. Наиболее сложной проблемой при проведении исследований in vivo является обнаружение образовавшихся de novo CNV. Это связано с тем, что CNV очень широко представлены в геноме человека и представляют значительный источник генетической вариабельности и изменчивости. Как показано, CNV связаны с человеческими мультифакториаль-ными заболеваниями, такими как восприимчивость к ВИЧ-инфекции, аутизм, шизофрения, онкологические заболевания и др. При помощи полногеномных технологий (микроматричного и NGS анализов) в 2008-2009 гг. выявлено более 38 000 CNV (> 1 kbp в размере) и много других структурных вариаций (SVs, включая уравновешенные инверсии и транслокации) [7, 13]. Намного реже встречаются CNV размером более 100 kbp. В среднем существует > 1 000 CNV в геноме человека (размером более 100 kbp), которые объясняют геномную вариабельность 4 млн пар азотистых оснований [14, 15]. Все вариации числа копий ДНК закаталогизированы в базе данных геномных вариантов (DGV, http://projects.tcag.ca/variation/). В настоящий момент DGV содержит 353 126 CNV и 1 645 инверсий. CNV, включённые в базу данных DGV, составляют 29,7% человеческого генома. Все варианты CNV из базы DGV включены в программу «Chromosome Analysis Suite 2.0». Таким образом, главная проблема заключалась в том, чтобы отличить образовавшиеся de novo CNV в организме обследуемого под действием ге-нотоксических факторов (в нашем случае - длительное радиационное воздействие) от его геномных CNV, обусловленных нормальной генетической изменчивостью. Идентификация индуцированных de novo CNV при радиационном воздействии in vivo значительно отличается от экспериментов in vitro, когда могут быть отслежены изменения, происходящие после облучения, при сравнении генетического ландшафта до и после облучения у отдельных клеточных клонов. При исследовании индивидов, уже подвергшихся радиационному воздействию, такой подход не возможен, и возникает необходимость жёстких критериев отбора CNV, которые образовались de novo, и обязательное их сравнение с базой данных геномных вариантов. Нами разработаны критерии для обработки результатов микроматричного исследования и выявления образованных de novo CNV. Все CNV рассмотрены и проанализированы «вручную». При этом не рассматривались CNV в теломерных и прецентромерных районах хромосом, так как в этих районах особенно высока частота CNV из базы DGV (нормальная генетическая изменчивость). Кроме того, возможны небольшие технические сбои при сканировании полиморфных и неполиморфных маркёров в этих регионах, которые могут обусловливать появление при анализе ложноположительных CNV. В качестве образовавшихся de novo CNV под действием ионизирующего излучения всегда признавались мозаичные делеции и амплификации, которые имели 4 аллельных пика. Мозаичность означает, что суммарная ДНК крови содержит и нормальную ДНК, и ДНК клеток с мутацией (делецией или амплификацией кого-либо локуса). При наличии мозаичной CNV микроматрица позволяет количественно определить частоту мутантной ДНК на фоне нормальной. Рассматривались только CNV размером более 100 kbp, они встречаются намного реже, чем CNV размером от 1 kbp. Считается, что в норме у человека менее 2-5 таких CNV. Большее их количество, как правило, может свидетельствовать о внешнем генотоксическом воздействии или происхождении данного индивида в результате родственных связей, это может наблюдаться в отдельных этнических группах, редко встречается как артефакт [15]. Если у обследованного работника СХК в крови наблюдалось более 5 CNV размером от 100 kbp, эти CNV рассматривались как кандидаты на происхождение de novo. Образовавшиеся de novo CNV обязательно должны отражаться на структуре аллельных пиков (должно происходить явное сужение при делеции или увеличение при амплификации), а их границы не должны соответствовать известным границам CNV из базы данных DGV. Разделение обследованных работников на группы. Согласно вышеперечисленным критериям общая когорта обследованных работников СХК, подвергавшихся облучению, была разделена на 2 группы. Если у обследованного работника находили хотя бы один участок с образовавшимся de novo CNV, его относили в опытную группу. Всех, у кого не найдено ни одного образовавшегося de novo CNV, относили в контрольную группу. В контрольную группу включено 27 человек, в опытную - 19 человек. Из них c мозаичными амплификациями - 9 человек (табл. 1, рис. 1). Рис. 1. Пример мозаичной амплификации 15-й хромосомы у работника #1792 (показана стрелкой) [Fig. 1. Example of the mosaic amplification of chromosome 15] 06V i ii i ii iii 1 и i null iii 11 maiи ii i и и ни и i и in Рис. 2. Мозаичная делеция 3-й хромосомы (показана стрелками) (работник #1490) [Fig. 2. The mosaic deletion of chromosome 3] Таблица 1 [Table 1] Хромосомная локализация, тип, размеры индуцированных de novo CNV и локализованные в регионе этих CNY гены [Location, type and size of CNV. Genes located in CNV] № # Тип CNV de novo [De novo CNV tvve\ Локализация [Location] Размер, kbp [Size, kbp] Начальный маркёр [Initial marker] Конечный маркёр [Terminal marker! Гены в локусе CAN [Genes located in CNV] 1 178 GainMosaic 22qll .23-12.1 266 S-4PCJB C-50BRY IGLL3P, LRP5L, CRYBB2P1 2 203 GainMosaic llpll .12 532 C-7FLLK S-4IVZX WC441601, LOC646813 3 278 GainMosaic 3pl4.2-14.1 7727 - S-3EXOD FHIT, PTPRG, LOCI 00506994, C3orfl4, FEZF2, C4DPS, LOC285401, SYNPR, SYNPR-AS1, SNTN C3orf49, THOC7, ATXN7, PSA1D6-AS2, PSKID6, PRICKLE2-AS1, LOCI00287879, PRICKLE2, PRICKLE2-AS2, PRICKLE2-AS3, ADAA ITS9, ADAA ITS9-AS2, MIR548A2, ALAGI1, K1AGI1-AS1, SLC25A26, LRIG1, KBTBD8, MIR4272, SUCLG2, F4A119A1 4 394 LossMosaic 6ql2 106 S-4QPOS S-3FDAM No Loss* 5ql4.3 146 S-4TGZB C-4WOCU No Loss 18ql2.1 141 S-4RASA S-3HLHI No 5 450 GainMosaic 22ql3.31 2044 C-3EHEM S-3FVAL TBC1D22A, LOC339685, FU46257, MIR3201, F4AI19A5, LOC284933, MIR4535, LOC100128946 Loss 3p24.3 144 C-4RQHI S-3XJXW No Loss* 13q21.31 163 C-7JMKF S-3WXWM No Loss* 5ql4.3 146 S-4TGZB C-4WOCU No Loss* 13q31.1 126 S-4EESI C-5CTOO No 6 620 GainMosaic 4pl6.1 420 C-3DTEO S-3GRIX ACOX3, TRAIT44, GPR78, CPZ 7 743 Loss 10q21.3 256 C-6QMFB C-4UDDJ CTNNA3, LRRTM3 Loss llq21 230 S-4HFBU C-4LGPB No 8 767 Loss 18q12.1 131 C-6BEIO S-4BCAY No to Продолжеиетабл. 1 [Table 1 (continuation)] № # Тип CNV de novo [De novo CNV tvve\ Локализация [Location] Размер, kbp [Size, kbp] Начальный маркёр [Initial marker] Конечный маркёр [Terminal marker! Еены в локусе CAN [Genes located in CNV] 9 792 GainMosaic 10q22.1 134 C-6UNLC C-6AHDO MM ITS 14 Loss 7p21.3 252 C-5NECB C-4STGM No RGPD5, RGPD6, LIMS3, LRLS3L, LRLS3- 10 805 Gain 2ql3 476 C-3FEMB S-4DKPL LOC440895, LOC440895, LOC100288570, ЮС440894, MIR4267, MALL, MIR4436B2, MIR4436B1, NPHP1, LINC00116 11 847 Loss* 8pll.22 238 S-3FIUN S-4.TOLS ADAK12, IDOl, ID02 Loss 8pll.22 140 C-6IVAT C-4LDXP ADAM5P ADAM3A Loss 4pl5.33 104 C-3MOKG S-3AOHG No 12 879 Loss* 13q21.31 132 C-6EDLV C-3NSAB No Loss 2pl3.3 124 C-3NSAB C-4NNNN FBX048, ,4PLF LossMosaic 3ql2.3-13.11 1910 C-7BPZ.T S-3CAZH ZPLD1, MIR548A3 PWRN2, PWRN1, NR4P1, SNRPN, SNURF, SNORD107, PAR-SN, R4R5, SNORD64, GainMosaic 15qll.2-13.1 4188 - C-5CDXN Группа SNORD108-116-29 UBE3A, ATP 1 OA, 13 1490 MIR4715, LOC100128714, LOC503519, GMRB3, GABRA5, GMRG3, OCA2 Loss 14q 11.2 263 S-3KVTR C-4TKFT No Gain* 3q25.31 105 S-3NIFX C-3YNEU LEKR1 Gain* 4q31.1 101 S-3TW.IM S-4EWRM SCOC, LOC100129858, CLGN Gain* 7pll.2 121 S-4PGGE C-5ZZNA No Loss 22qll .23-12.1 266 S-4PC.IB C-5QBRY IGLL3P, LRP5L, CRYBB2P1 PPYR1, LOC643650, LOC728643, ANXA8, 14 1499 Gain 10qll.22 1088 C-4NTNB C-6LQLF ANXA8L1, FMI25B, FMI25G, FMI25C, AGAP9, BMS1P6, BMS1P2, FMI35B2, ANTXRL, ANXA8L2, FMI21B, CTSL1P2 Fpyima SNORDU 5-116-29, UBE3A, ATP 1 OA, 15 1502 GainMosaic 15qll.2-12 2754 - C-6WKMN MIR4715, LOC100128714, LOC503519, GMRB3, GABRA5, GMRG3, OCA2 Окончаиетабл. 1 [Table 1 (end)] № # Тип CNV de novo [De novo CNV tvpe\ Локализация [Location] Размер, kbp [Size, kbp] Начальный маркёр [Initial marker] Конечный маркёр [Terminal marker! Еены в локусе CAN [Genes located in CNV] 16 1557 Loss 14q 11.2 574 S-3NMYC C-4MTZE No 17 1579 Loss 14q 11.2 476 C-6AXUP S-4PHOG No 18 1620 GainMosaic 22qlL23-12.1 269 C-6XUNK S-3SDXV IGLL3P. LRP5L. CRYBB2P1 19 1792 GainMosaic 15qlL2 841 С-ЗОХ.1М C-6VPEO PWRN2. PWRN1 GainMosaic 22qlL23-12.1 266 S-4PCJB C-50BRY IGLL3P. LRP5L. CRYBB2P1 Loss 4q28.3 364 S-3IPLP C-4AAEA no Loss 18q2L2 102 C-5ETOT S-3BDMC LOCI 00505474 делеция; * - область CNV отсутствует в базе DGV [Note. Loss - deletion; Gain - amplification; GainMosaic - mosaic amplification; LossMosaic - mosaic deletion; * is absent in the DGV database]. Мозаичная делеция наблюдалась у 2 работников: в 3-й хромосоме у обследованного #1490 (рис. 2, слившиеся аллельные пики) и у работника 394 в длинном плече 6-й хромосомы (см. табл. 1). Всего у 12 работников выявлены образовавшиеся de novo делеции, которые удовлетворяют критериям 1 (не находились в теломерных и прецентромерных районах), 3 (размером более 100 kbp) и 4 (отражались на структуре аллельных пиков и их границы не соответствовали известным границам CNV из базы данных DGV). У 9 работников общее количество CNV размером > 100 kbp более 5, во всех этих случаях отмечались протяжённые делеции или амплификации (в том числе и мозаичные), которые в соответствии с критерием 4 классифицированы как индуцированные de novo CNV, а эти работники отнесены в опытную группу. Геномная локализация и размеры индуцированных de novo CNV. В табл. 1 представлены хромосомные локализации, тип, размеры всех индуцированных de novo CNV и локализованные в регионе этих CNV гены. Всего у 19 работников СХК из опытной группы обнаружено 39 индуцированных de novo CNV различных типов. Из них 11 мозаичных амплификаций, 2 мозаичные делеции, 21 делеция и 5 амплификаций. Средний размер индуцированных de novo CNV составил 714±228 kbp (минимальный - 101 kbp, максимальный - 7 727 kbp). Размер амплификаций (включая мозаичные) составил 1 333±514 kbp, размер делеций (включая мозаичные делеции) -284±78 kbp (p-value = 0,02 по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни). Чаще возникают делеции, но их протяжённость статистически значимо меньше, чем амплификаций. Индуцируемые de novo CNV распределены по геному и отмечаются во многих хромосомах (за исключением 1, 9, 12, 16, 17, 19, 20 и 21-й хромосом, что связано с малочисленностью выборки), в половых хромосомах CNV не учитывались. Наибольшая частота индуцируемых CNV отмечена в 22-й хромосоме (5 из 39), причём из них 4 случая выявлено в локусах 22q11.23-12.1. В трех случаях гены (IGLL3P, LRP5L, CRYBB2P1), локализованные в этом регионе, оказываются амплифицированы, в одном случае - делетированы. В 3-й и 4-й хромосомах - по 4 CNV. Как показал M.F. Arlt с соавт. (2014), ра-диационно-индуцированные CNV в геноме фибробластов, подвергавшихся облучению, располагались по всему геному, но концентрировались в «горячих точках», где расположены ломкие участки хромосом. Наибольшая концентрация возникающих de novo CNV наблюдалась в 3, 7 и 15-й хромосомах [8], что несколько отличалось от нашего распределения. Таким образом, несмотря на то, что есть некоторые районы, более подверженные образованию de novo CNV, можно полагать, что возникновение CNV носит стохастический характер. Это свидетельствует в пользу радиационной природы возникновения новых CNV. Сравнение частот цитогенетических аномалий в опытной и контрольной группах. Чтобы утверждать, что детекция образовавшихся de novo CNV в геномной ДНК крови работников, подвергавшихся радиационному воздействию, свидетельствует об их высокой радиочувствительности, надо показать (хотя бы косвенно) повышенный уровень радиочувствительности этих индивидов. Опытная и контрольная группы не различались по суммарной дозе внешнего облучения (р = 0,6785 по критерию Вилкок-сона - Манна - Уитни). Один из возможных способов, который косвенно может показать радиочувствительность индивида, - это обнаружение повышенного уровня цитогенетических аномалий в лимфоцитах крови, определяемых при помощи стандартного метода, при равных дозовых нагрузках. Проведено сравнение частоты хромосомных аберраций в опытной и контрольной группах работников СХК (табл. 2). Установлено, что в лимфоцитах крови работников из опытной группы, где детектировались индуцированные de novo CNV, более чем в 2 раза выше частота аберрантных клеток и в 3 раза выше частота парных фрагментов. Т а б л и ц а 2 [Table 2] Частота хромосомных аберраций, выявляемых при помощи стандартного цитогенетического исследования в опытной и контрольной группах работников СХК, подвергавшихся длительному радиационному воздействию [The frequency of chromosomal aberrations in the cohort of Siberian Group of Chemical Enterprises employees exposed to long-term irradiation ] Показатель [Indicator] Частота хромосомных аберраций на 100 клеток (M±SE) [The frequency of chromosomal aberrations/100 cell] p-value Опыт [Case] Контроль [Control] Количество аберрантных клеток [Number of aberrant cells] 8,40±2,18 3,80±0,99 0,0082 Хроматидные фрагменты [Chromatid fragments] 1,13±0,39 0,70±0,25 0,6232 Парные фрагменты [Pair fragments] 1,82±0,32 0,60±0,13 0,0036 Кольца [Rings] 0,17±0,11 0,07±0,04 0,8798 Дицентрики [Dicentrics] 0,07±0,07 0,03±0,03 0,9698 Примечание. М - средняя арифметическая, SE - ошибка средней, полужирным шрифтом выделены статистически значимые различия, p-value - уровень статистической значимости, определяемый при помощи непараметрического критерия Вилкоксона - Манна - Уитни [Note. М - mean, SE - standard error, p-value - determined by Wilcoxon-Mann Whitney test]. Таким образом, с учётом одинаковых доз облучения в контрольной и опытной группах, проведённый цитогенетический анализ позволяет предполагать у индивидов опытной группы повышенный уровень радиочувствительности. В отличие от нестабильных хромосомных аномалий, выявляемых при помощи рутинного цитогенетического исследования, которые очень быстро элиминируются после радиационного воздействия, аберрации числа копий ДНК стабильны и могут длительное время поддерживаться клонами мутированных клеток (например, костного мозга) в организме. В настоящее время известно 4 основных механизма возникновения CNV: NAHR (nonallelic homologous recombination - неаллельная гомологичная рекомбинация), NHEJ (nonhomologous end-joining - негомологичное соединение концов), Line1-опосредованная ретротранспозиция и FoSTeS (fork stalling and template switching - остановка вилки репликации и изменение матрицы) [7]. NAHR, как правило, происходит в мейозе и приводит к конститутивным геномным транслокациям, которые могут не оказывать существенного влияния на адаптивные возможности организма или проявляться как возникающие de novo геномные нарушения [16]. В редких случаях NAHR может также встречаться и при митозе (например, при восстановлении разрывов ДНК при воздействии радиации); в результате образуются мозаичные группы соматических клеток, несущие CNV [17, 18]. NHEJ - один из основных механизмов, которые используются клетками человека для восстановления DSB после воздействия радиации или активных форм кислорода. NHEJ не требует субстратов с гомологией, в отличие от NAHR, и практически всегда оставляет «информационный рубец» в виде делеций или дупликаций нескольких нуклеотидов в месте соединения [19], т.е. механизм NHEJ способен образовывать только очень короткие CNV. J. Xing c соавт. (2009) показали, что механизм Line1-опосредованной ретротранспозиции отвечает примерно за 10% in/del коротких вариаций в геноме, что показывает важную роль автономного транспозона Line1 в формировании индивидуальной структурной вариабельности генома человека [20]. Считается, что одним из основных механизмов возникновения CNV является FoSTeS, который приводит к образованию крупных амплификаций, делеций и сложных транслокаций вплоть до перестановок целых экзонов и дупликаций генов. Этот основанный на репликации ДНК механизм FoSTeS может быть ответствен за эволюционные изменения генома, появление новых функций генов, единовременные патологические изменения генома, а также может приводить к сложным сегментарным дупликациям или структурным CNV в ответ на воздействие факторов внешней среды [21-23]. Образование новых CNV под действием радиации обеспечивается благодаря SSB и ре-пликативному стрессу. Если репликативная вилка сталкивается с SSB, вилка может привести к коллапсу репликации, новым репликативным вилкам и образованию одностороннего DSB [24]. Ионизирующее излучение индуцирует SSB в 20 раз чаще, чем DSB [2], и они, несомненно, вмешиваются в репликацию, создавая новые репликативные вилки, обеспечивая функционирование механизма FoSTeS и образование новых CNV под действием радиации [8]. Новые CNV (в том числе и благодаря механизму FoSTeS) могут образовываться и в клетках организма человека, подвергающегося радиационному воздействию, если воздействию подвергаются митотически активные клетки, например клетки костного мозга. Можно предположить, что клетки с образовавшимися de novo CNV при длительном радиационном воздействии будут формировать клоны в костном мозге и их потомки лейкоциты будут накапливаться в крови облучённых лиц в количествах, достаточных для детекции при помощи микроматричного анализа высокой плотности. CNV, с одной стороны, могут отвечать за генетическую компоненту индивидуальной радиочувствительности, обеспечивая вариабельность системы репарации; с другой стороны, CNV могут возникать de novo под действием радиации и фактически отражать чувствительность организма (или его способность к репарации) к SSB. Заключение Таким образом, показано наличие в лимфоцитах крови 19 из 46 обследованных работников СХК, подвергавшихся длительному радиационному воздействию низкой интенсивности, крупных CNV (средний размер CNV составил 714 ± 228 kbp, минимальный - 101 kbp, максимальный - 7 727 kbp), образовавшихся de novo (мозаичных амплификаций и делеций, крупных делеций и амплификаций) и распределённых по геному. В группе работников, имеющих индуцированные de novo CNV, выявлена повышенная частота аберрантных клеток и парных фрагментов хромосом в лимфоцитах периферической крови по сравнению с группой работников, не имеющих индуцированные de novo CNV, при этом обследованные группы не различались по суммарной дозе радиационного облучения. Это позволяет предположить повышенный уровень радиочувствительности у работников СХК с индуцированными de novo CNV, которые могут детектироваться даже при невысоких уровнях облучения и, таким образом, служить маркёром высокой радиочувствительно сти

Скачать электронную версию публикации