Studying Tilia cordata Mill. intraspecific variation on the basis of leaf bilateral asymmetry.pdf Введение В феногенетических исследованиях широко используются три вида билатеральной асимметрии. Большинство авторов склоняется к тому, что направленная асимметрия (НА) и антисимметрия (АнС) - это проявления изменчивости, кодируемые генотипом, поэтому к ним в большей степени применим термин «генотипическая изменчивость». Третий вид билатеральной асимметрии - флуктуирующая асимметрия (ФА). Этот вид асимметрии определяется как незначительные и ненаправленные отклонения морфологических признаков от идеальной симметрии. ФА как вид фенотипической изменчивости изучалась с начала ХХ в. и подробно рассмотрена в работах Р. Палмера, К. Стробека и других авторов [1, 2]. ФА считается проявлением фенотипа, которое зависит от воздействий со стороны среды, хотя и не исключается канализированное, полностью не объясненное воздействие на нее генотипа [3]. Такой вид асимметрии используется для оценки стабильности развития как способности организма регулировать его на филогенетическом уровне. ФА характеризуется нормальным распределением разностей (R-L) вокруг нуля, где R и L - размеры правого и, соответственно, левого гомологичных билатерально симметричных признаков. Считается, что величина ФА показывает относительную неэффективность организменных систем контроля процессов развития [1, 2]. В практике биоиндикации флуктуирующая асимметрия используется для тестирования стрессовых воздействий на организм, хотя в некоторых работах указывается и на аналогичное свойство направленной асимметрии [3-5]. Направленная асимметрия и антисимметрия привлекают интерес генетиков и экологов, так как проявление этих видов асимметрии содержит как генотипический компонент, так и чисто фенотипический элемент вариации, обусловленный действием окружающей среды. Примеси НА и АнС не позволяют точно определить величины ФА. Присутствие этих двух видов асимметрии удается оценить количественно [1, 2]. В литературе по экологическому мониторингу и оценке стабильности развития весьма редко встречаются работы, посвященные направленной асимметрии и антисимметрии, определяемых в абсолютном значении или в терминах статистической вероятности. Между тем эти два вида асимметрии, как и флуктуирующая асимметрия, имеют органную, индивидуальную и групповую (популяционную) изменчивость и, по некоторым данным, могут, как и флуктуирующая асимметрия, отражать уровень стабильности развития [5]. Направленная асимметрия характеризуется асимметричным распределением частот (R-L) в гистограммах и обычно сопутствует флуктуирующей асимметрии. Признаки, содержащие НА в таких случаях, исключаются из интегрального общего усредненного значения. Антисимметрия как вид ненаправленной асимметрии также сопутствует флуктуирующей асимметрии. Бимодальное и плосковершинное распределения частот значений (R-L) характерны для АнС, а нормальное распределение характерно для флуктуирующей асимметрии. Островершинная форма распределения частот (R-L) часто характеризует смесь флуктуирующей асимметрии и антисимметрии, что означает проявление фенотипической и одновременно генотипической изменчивости [1]. Величина НА находится на основе различия величин правого и левого признаков. Присутствие АнС определяется величиной эксцесса у. На практике используются табулированные значения эксцессов при их непараметрическом распределении, получаемые с помощью искусственного размножения выборок (R-L) и, в большей степени, на основе данных лабораторного биологического материала. Подробно процедуры определения НА и АнС описаны в зарубежных [1, 2] и отечественных [3, 6] публикациях. Работ по скринингу и изучению воздействия различных факторов на число и величину выбросов числовых значений в выборке немного. Главным образом это работы в области морфогеометрического изучения черепов некоторых млекопитающих и человека [7]. Возрастает число публикаций о внутреннем и внешнем эффектах в ответ на стрессирующие факторы, длительность и характер фило- и онтогенеза млекопитающих [8], а также о совместной генотипической и фенотипиче-ской ответной реакции в виде совокупного проявления НА, АнС и флуктуирующей асимметрии. В предыдущих исследованиях сообщалось о снижении стабильности развития липы мелколистной при воздействии поллютантов со стороны химического предприятия [9-12], при воздействии оксидов серы [13], а также об изменении морфологических характеристик листовых пластин [14]. Поскольку флуктуирующая асимметрия проявляется (хотя и не всегда) при стрессовых воздействиях, выбраны экспериментальные территории (лока-литеты), находящиеся в разных экологических условиях. Целью настоящего исследования являлось изучение проявлений трех видов билатеральной асимметрии в трех экспериментальных популяциях липы мелколистной (Tilia cordata Mill.) и, следовательно, генотипических и фенотипических проявлений в величине билатерально симметричных признаков на популяционном уровне изменчивости. Материалы и методики исследования Сбор и гербаризация материала проводились в течение 2004-2007 гг. по методике В.М. Захарова [15]. С каждой из трех экспериментальных территорий ежегодно собиралось по 100 максимально приближенных по размеру листьев липы мелколистной и определялись их метрические признаки (рис. 1). Первое место сбора располагалось в центре г. Орехово-Зуево Московской области в 30 м к югу от АЗС «British Petroleum» (АЗС BP) (55°48'13.8''N; 38°58'23.8''E). Второе место сбора выбрано в западной части г. Орехово-Зуево в 70 м к юго-западу от территории химического завода «Карболит», выпускающего пластмассы на основе фенолформаль-дегидных смол, и в 30 м от автодороги, идущей параллельно территории этого предприятия (55°48'13.1''N; 38°58'23.9''E). Третья точка находилась на территории Крутовского заказника, в пойменном лесу правобережья р. Клязьмы в 8 км юго-восточнее г. Петушки Владимирской области (55°53'44.1''N; 39°25'43.8''). Ход определения трех видов асимметрии основан на методологическом подходе, подробно разработанном А. Палмером и К. Стробеком [1, 2]. Под выборкой понимался ряд значений |R-L|/(R+L) по каждому признаку для каждой популяции за каждый год. Рис. 1. Признаки для определения флуктуирующей асимметрии листовых пластин липы мелколистной (Tilia cordata Mill.): 1 - ширина середины листа; 2 - расстояние между основаниями первой жилки первого порядка и второй жилки второго порядка; 3 - расстояние между основаниями второй и третьей жилок второго порядка; 4 - расстояние между основаниями первой и второй жилок первого порядка; 5 - угол между рахисом и первой билатеральной жилкой [Fig. 1. Traits to determine the fluctuating asymmetry of FA Tillia cordata (Mill.) leaves: 1 - leaf width; 2 - distance between the bases of the first vein of the first order and the second vein of the second order; 3 - distance between the bases of the second and the third veins of the second order; 4 - distance between the bases of the first and the second veins of the first-order; 5 - angle between the rachis and the first bilateral vein] Проверка отклонений выборок от нормального распределения проводилась с помощью программы SPSS 14 (SAS Inc.) и основана на выбраковке значений, которые при сравнении со средним и при отнесении к стандартному отклонению выборки превышают критические. Проверка на присутствие направленной асимметрии проводилась парным двухвыборочным t-тестом для средних значений (MS Excel). НА как проявление популяционной гено-типической изменчивости оценивалась для каждой выборки. Проведен регрессионный анализ на присутствие корреляционной связи между размером признака (R+L)/2 и флуктуирующей асимметрией |R-L|/ (R+L) для каждой популяции по каждому году. Этот анализ необходим, чтобы установить, не является ли величина ФА признака зависимой от размера признака. Присутствие антисимметрии проводилось с использованием описательной статистики выборок |R-L|/(R+L) и сравнением значений эксцесса с табличными данными [2]. Общее количество выборок: 60 = 5 признаков х 3 локалитета х 4 года наблюдения. Определение флуктуирующей асимметрии проводилось по формуле |R-L|/(R+L). ФА рассматривалась как проявление популяционной феноти-пической изменчивости и находилась по каждому из пяти признаков за каждый год. Для этого строились матрицы планов с данными по каждой листовой пластинке. В среде SPSS выполнялся двухфакторный анализ влияния на флуктуирующую асимметрию факторов «место сбора» и «год сбора». Анализ на нормальность распределения проводился тестом Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса для проверки нулевой гипотезы. При уровне статистической значимости р > 0,05 делался вывод об отклонении от нормального распределения разности (R-L). Большинство статистических анализов выполнялось с помощью программных средств MS Excel и SPSS 14. Результаты исследования Отклонение от нормальности Наибольшее число значений (R-L), т.е. выбросов, способствующих отклонению выборки от нормального распределения, отмечено в сборах листьев, собранных вблизи АЗС BP. Эти значения регистрировались в среде SPSS в виде точек, отклоняющих распределение частот (R-L) от формы нормального распределения. Наибольшее количество выбросов за весь период наблюдения (28,5%, n = 100) получено в выборках, соответствующих 4-му признаку в районе АЗС BP (табл. 1). Т а б л и ц а 1 [Table 1] Количество выбросов (% от выборки) [Emissions (% of sampling)] Признак [Trait] АЗС ВР [BP gas station] Завод «Карболит» [Chemical plant CARBOLIT] ООПТ Крутовский [Krutovsky conservation area] 1 5,50 1,75 0,00 2 2,75 2,75 1,67 3 6,50 5,00 3,33 4 28,50 4,50 8,33 5 3,75 0,50 2,67 X 47 14,5 16 Генотипическая изменчивость Т-тест на проверку равенства величин правого и левого признаков (n = 100) показал присутствие направленной асимметрии (р < 0,005) только в одной выборке (1-й признак, 2004 г., завод «Карболит»). В то же время анализ данных с этого места сбора показал наибольшие значения флуктуирующей асимметрии и в 2004 г., но по 4-му признаку. Таким образом, направленная асимметрия как генотипический популяционный признак статистически значимая в том же локалитете и в тот же год, когда зарегистрирована самая высокая флуктуирующая асимметрия. На популяционном уровне значимых эксцессов, запредельно превышающих табличные значения (n = 100; a = 95%), не найдено ни по одному из признаков. Значения эксцессов у не выходили за пределы диапазона [-3 +3], что соответствовало нормальному распределению значений (R-L). Анализ Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса на нормальность распределения показал нормальное распределение (р > 0,05). Не обнаружено связи между размером признака (R+L)/2 и величиной ФА, так как коэффициент корреляции Пирсона не показал высоких значений (r = 0,1-0,5). Фенотипическая изменчивость При изучении фактора «год сбора» анализ флуктуирующей асимметрии дал значимые различия для 4-го и 5-го признаков (р < 0,005). Анализ фактора «место сбора» и взаимодействия обоих факторов показал высокую фено-типическую изменчивость ФА по каждому признаку (табл. 2). Т а б л и ц а 2 [Table 2] Изменчивость величины флуктуирующей асимметрии пяти признаков в зависимости от года (2004-2007), места сбора и взаимодействия факторов [Variability of fluctuating asymmetry value of five traits depending on the observation year (2004-2007), the site and the factor interaction] Источник вариации [Source of variation] trait ss df MS F р 1* 0,001 3 0,000 0,483 0,694 Год исследования [Year] 2 0,005 3 0,002 0,693 0,557 3 0,004 3 0,001 0,520 0,669 4 0,012 3 0,004 3,425 0,017 5 0,009 3 0,003 4,070 0,007 1* 0,012 2 0,006 10,468 0,000 Место сбора [Site] 2 0,048 2 0,024 10,414 0,000 3 0,028 2 0,014 5,287 0,005 4 0,083 2 0,041 38,967 0,000 5 0,005 2 0,002 3,424 0,033 1* 0,018 10 0,002 3,161 0,001 Год x место сбора [year x site] 2 0,062 10 0,006 2,653 0,003 3 0,062 10 0,006 2,653 0,003 4 0,119 10 0,012 11,514 0,000 5 0,016 10 0,002 2,258 0,013 Примечание. SS - сумма квадратов; df - степень свободы; MS - средний квадрат; F -показатель Фишера; р - уровень значимости; * - направленная асимметрия, 2004 г [Note. SS - sum of squares; df-degree of freedom; MS - mean square; F - Fisher index; p - level of significance; * - directional asymmetry, 2004]. Наибольшее статистически значимое различие по флуктуирующей асимметрии по фактору «место сбора» показал 4-й признак (F = 38,97; р < 0,000). Наивысшую статистическую значимость по этому признаку дал и двухфак-торный анализ (F = 11,51; р < 0,000). Максимальное значение флуктуирующей асимметрии по 4-му признаку получено в процессе изучения листовых пластин липы мелколистной, произрастающей в районе завода «Карболит», в 2006 г. (0,058±0,002). Для сравнения: этот показатель у АЗС BP равен 0,030±0,002, а на территории заказника - 0,042 ± 0,002 (рис. 2). 0,080,070,060,050,040,030,02ф -о £ Ш Ш 2 3 1 1 3 1 2 3 1 2 d 3 c a Рис. 2. Динамика флуктуирующей асимметрии за 2004-2007 гг. по 4-му признаку: 1 - АЗС ВР; 2 - заказник; 3 - завод «Карболит» (а - 2004 г, б - 2005 г; в - 2006 г., г - 2007 г.). По оси ординат - величина флуктуирующей асимметрии, данные представлены в виде средней с доверительным интервалом 95% (р < 0,01) [Fig. 2. Fluctuating asymmetry dynamics in 2004-2007, the fourth trait: 1 - BP gas station, 2 - conservation area, 3 - chemical plant Carbolit, a - 2004, b - 2005, c - 2006, d - 2007). Y-axis - FA value. Data are presented as a mean with 95% confidence interval (р < 0.01)] Обсуждение результатов исследования Определение отклонений выборок от нормального распределения зачастую является важным моментом предварительной инспекции величин гомологичных билатеральных признаков. Точки выбросов как значения, выходящие за пределы доверительного интервала, содержат информацию о степени отклонения от нормального распределения величин, а значит, и о вероятном присутствии антисимметрии. Количество значений выбросов в процентном отношении к общему числу по 4-му признаку оказалось наибольшим в районе АЗС ВР. Считаем, что это обстоятельство не случайно. Присутствие большого числа значений выбросов частотного распределения (R-L) по 4-му признаку в экспериментальной популяции в районе АЗС ВР является косвенным подтверждением их роли в биоиндикационной характеристике химического загрязнения окружающей среды вблизи АЗС и вдоль автомагистрали. Большое число значений выбросов по 4-му признаку характеризует его как более чувствительный к изменению факторов среды. Это подтверждается результатами двухфакторного анализа (место х год сбора). Анализ взаимодействия этих факторов показал высокую изменчивость ФА как проявления фенотипической изменчивости. Вблизи химического завода наблюдалось стойкое повышенное значение ФА по 4-му признаку при четырехлетнем наблюдении. Рост производства продукции завода «Карболит» в 2004-2006 гг. мог вызвать ответную реакцию в экспериментальной популяции липы мелколистной в виде снижения стабильности развития, приводящей к увеличению величины ФА. Структурно этот признак связан с главной жилкой (рахис), объединяющей проводящую систему листа с тканями листовой пластинки. Хронологически он развивается раньше остальных и заслуживает особого внимания для целей биоиндикации по показателю ФА. Антисимметрия как высоко отрицательное значение эксцесса не обнаружена. Это довольно редко встречающийся вид асимметрии у листовых пластин древесных растений [3]. Из трех экспериментальных популяций в течение 4 лет генотипическая изменчивость проявилась в виде направленной асимметрии (по 1-му признаку) в год, когда получено самое высокое значение флуктуирующей асимметрии по 4-му признаку. Это позволяет сделать вывод о некой трансформации формы листовой пластины, являющейся проявлением популяционной изменчивости одновременно генотипического (НА) и фенотипического происхождения (ФА). Флуктуирующая асимметрия как фенотипический признак различалась и территориально, и в зависимости от времени сбора. Наиболее статистически значимым признаком при оценке стабильности развития 4-й признак - расстояние между основаниями 1-й и 2-й жилок первого порядка. Этот признак с высокой статистической значимостью различался по годам сбора листьев в разных популяциях. Следовательно, в условиях Подмосковья этот признак тоже целесообразно использовать для тестирования стабильности развития липы мелколистной. Химический завод «Карболит» в начале 2000-х гг. увеличил мощность по производству пластмасс (максимальный объем производства зафиксирован в 2007 г.), поэтому повышение ФА в 2004 г. может служить косвенным подтверждением ранних нарушений стабильности развития экспериментальной популяции липы мелколистной. Снижение стабильности развития можно объяснить в этом случае большим количеством токсичных соединений в окружающей среде, образующихся во время производства, прежде всего диоксида углерода (СО2) и триоксида серы (SO3). Результаты работы не означают преимущественного использования отдельно взятых признаков, а напротив, предполагают интегральный анализ, основанный на морфогеоме-трическом подходе учета размера, формы и величины билатеральных параметров. Заключение Первым по статистической значимости фактором, влияющим на ФА, -фактор «место сбора». Второе по значимости - совместное влияние двух факторов: места и времени сбора листовых пластин. В районе влияния химического комбината получены статистически значимые значения двух видов асимметрии: направленной и флуктуирующей. Полученные данные свидетельствуют о генотипической и фенотипической природе билатеральной асимметрии в листовых пластинах в ответ на близость промышленного источника загрязнения.

Скачать электронную версию публикации