Vector DNA fragments integrating into transgenic carrot genome during Agrobacterium-mediated transformation.pdf Введение Агробактериальная трансформация - один из наиболее широко используемых методов введения чужеродных генов в геном не только двудольных, но и некоторых однодольных видов растений. Гены, представляющие интерес для исследователя, клонируются между двумя несовершенными краевыми повторами Т-ДНК (левым и правым), единственными элементами в цис-положении, необходимыми для переноса. Оба повтора опознаются в бактериальной клетке белками vir-комплекса VirD1/VirD2. Белок VirD2 осуществляет одноце-почечный надрез, обычно между 3-м и 4-м нуклеотидами краевого повтора. Затем, начиная со свободного 3' конца (надрез в области правого краевого повтора), путем замещения «нижней» нити ДНК образуется одноцепочечная нить Т-ДНК (Т-нить). Белок VirD2, выполняющий роль транспортного белка, доставляет Т-нить из бактериальной клетки в растительную [1]. До середины девяностых годов общепринятым оставалось представление о том, что в растительную клетку переносится только Т-ДНК, заключенная между краевыми повторами. Однако рядом исследователей было показано, что это не всегда так [2, 3]. Установлено, что перенос пограничных векторных последовательностей в растительный геном происходит достаточно часто и не зависит от вида трансгенных растений, использованных векторов (коинтегративные, бинарные) и типов присутствующих в генетической конструкции краевых участков (нопалиновые, октопиновые) [4-10]. Более того, в геноме трансгенных растений выявлялись различные типы векторных последовательностей, часть из которых интегрировалась в геном в виде последовательностей, сцепленных с Т-ДНК, тогда как часть других -независимо от Т-ДНК [4, 7, 9]. В настоящее время существуют две гипотезы, объясняющие возможный механизм переноса векторных последовательностей, основанные на ошибках опознавания белками vir-комплекса правого и левого повторов, фланкирующих Т-ДНК. В случае если левый концевой повтор не опознается белками vir-комплекса, то процессинг Т-ДНК не прерывается (проскакивается) на левом концевом повторе и вслед за Т-ДНК реплицируется векторная последовательность, сцепленная с Т-нитью [6, 9]. Согласно второй гипотезе левый концевой повтор неправильно опознается (как правый) и репликация ДНК начинается с него, проходит всю векторную последовательность, затем, минуя правый концевой повтор, проходит всю Т-ДНК и оканчивается на левом повторе [5, 10]. Встраивание векторных последовательностей в геном трансгенных растений представляется нежелательным явлением. Нуклеотидные последовательности прокариотического происхождения, интегрированные в растительный геном, подвергаются метилированию и, таким образом, инактивируются как чужеродные [11]. Метилирование чужеродных последовательностей, сцепленных с Т-ДНК, влияет у трансгенных растений на стабильность экспрессии перенесенных генов [8, 12]. Известны примеры, когда повторяющиеся участки, или ori-репликации, содержащиеся в векторной ДНК, стимулировали перестройки внутри инсерции Т-ДНК [13, 14]. Наличие векторных последовательностей затрудняет исследование районов растительной ДНК, прилежащих к Т-ДНК. Кроме того, перенос в растительный геном генов устойчивости к антибиотикам или селективных маркеров, входящих в состав векторной последовательности, также представляется нежелательным. В настоящее время трансгенные растения широко используются в мире для различных целей, в том числе и как источники различных рекомбинант-ных белков (антител, цитокинов, факторов роста, гормонов, рекомбинантных ферментов, а также человеческих и ветеринарных вакцин) [15, 16]. Растения, которые можно употреблять в пищу без предварительной обработки, предоставляют широкие возможности для производства биофармацевтических препаратов. Ранее нами были получены трансгенные растения моркови, продуцирующие интерлейкины 10 и 18 человека, белки-иммуногены CFP10 и ESAT6 Mycobacterium tuberculosis, а также S- и M-антигены вируса гепатита В [17-19]. Согласно правилам коммерциализируемые сорта трансгенных растений не должны содержать никаких последовательностей векторной ДНК, лежащей за пределами Т-ДНК. В связи с этим выяснение частоты, с которой могут быть отобраны трансгенные растения, несущие в геноме фрагменты векторной ДНК, уточнение механизмов и особенностей их встраивания представляется актуальным и определяет цель настоящей работы. Материалы и методики исследования В качестве исходного материала было использовано 119 трансгенных (Т0) растений моркови, содержащих маркерный ген неомицинфосфотранс-феразы II (nptll) и целевые гены интерлейкина-18 человека, иммуногенов M. tuberculosis и вируса гепатита В. Все конструкции для трансформации растений были созданы на основе плазмиды pBI121. Трансгенные растения были получены стандартным методом агробактериальной трансформации [20]. Растительную ДНК выделяли стандартным методом [Там же]. Правый и левый концевые повторы Т-ДНК расположены в плазмиде pBI121 между 2454-2478 и 8621-8646 пн соответственно. Общая протяженность последовательности ДНК плазмиды pBI121, расположенной за пределами Т-ДНК, 8600 пн, она содержит восемь генов и два сайта инициации репликации. Для детального анализа схемы встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений при помощи программы Oligo был сконструирован ряд праймеров. Используемые в работе праймеры представлены в табл. 1. Схема расположения мест прикрепления всех пар праймеров приведена на рис. 1. Праймеры на векторную ДНК BD1/2, BD3/4, BD5/6, BD 7/8 и BD 9/10 использовались в мультиплексном ПЦР конкурентно с двумя другими парами праймеров - на ген nptll и ген моркови, кодирующий экстенсин. Реакционная смесь для амплификации объемом 20 мкл содержала: 60 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1,5 mM MgCl2; 25 mM KCl; 10 mM 2 - меркапто-этанола; 0,1% Тритон Х-100; 0,2 mM каждого dNTP; по 0,25 рM праймера на векторную ДНК; по 0,12 рM праймера на геномную ДНК моркови соответственно; по 0,12 рM праймера на ген неомицинфосфотрансферазы; 2 ед. термостабильной Taq-ДНК-полимеразы (СибЭнзим, Новосибирск); 30 нг выделенной ДНК. Т а б л и ц а 1 [Table 1] Праймеры, используемые в эксперименте. Начальная позиция фрагмента указана относительно сайта инициации репликации плазмиды pBI121 [PCR primers used in this study. Starting position of the fragment is relative to the ori of plasmid pBi121] Обозначение фрагмента [Target] Последовательность праймеров 5'-3' [Primer sequence 5'-3'] Начальная позиция (пн) [Starting position] Длина фрагмента (пн) [Fragment length] Фрагмент BD1/2, прилежащий к RB [Fragment BD1/2 adjacent to the RBI BD1 ACGTGAAACCCAACATACCC BD2 ATGTGCATGCCAACCACAG 1809 nt 284 bp Фрагмент BD3/4, прилежащий к LB [Fragment BD3/4 adjacent to the LB1 BD3 GATACAGGCAGCCCATCAGTC BD4 TAGCGCCACTCAGCTTCCTCAG 8698 nt 331 bp Фрагмент BD5/6 в середине векторной ДНК, ближе к LB [Fragment BD5/6 in the center of the vector sequence closer to the LB] BD5GCAATGAAGTCGGTCCC BD6 GCGGACAAGTGGTATGAC 11 494 nt 348 bp Фрагмент BD7/8 в середине векторной ДНК, ближе к RB [Fragment BD7/8 in the center of the vector sequence closer to the RB] BD7 CGCCATGAAGTCCGTGAATG BD8 TAAGTGCCCTGCGGTATTGA 13 867 nt 582 bp Фрагмент BD9/10 в середине векторной ДНК, ближе к RB [Fragment BD9/10 in the center of the vector sequence closer to the RB] BD9 CTGACGCCGTTGGATACAC BD10 GCTCACTCAAAGGCGGTAAT 661 nt 519 bp Ген nptll из Т-ДНК области [Gene nptll, from T-DNA region] npt1 CGACGTTGTCACTGAAGCG npt2 AAGCACGAGGAAGCGGTCAG 3080 nt 487 bp Хозяйский ген моркови, кодирующий экстенсин [Carrot host gene encoding extensin] car1 ACCTCCTCCTCCTCACCACTAC car2 TAAGTTGGCCTCCATCAGTGTC 249 bp Ген ftsA A. tumefaciens [A. tumefaciens gene ftsA] A CATGATCGGCCGGCTGACA A, TGCGCAGGTCGCTTGCTTC 2007165 nt 277 bp Праймеры для секвенирования [Primers for sequencing] pbi1 GACCTGCAGTCTCATATTCACTCTCAATCC 2783 nt pbi2 GATGGATCCATAAATTCCCCTCGGTATCCA 2754 nt pbi3 GACCTGCAGTCGTTTCCCGCCTTCAGT 2513 nt pbi4 GATGGATCCTTAATTCTCCGCTCATGATC 2540 nt pbi5 GACGGATCCACTACGTGAACCATCAC 8294 nt pbi6 CACGGATCCGTCTATCAGGGCGATGG 8314 nt pbi7 GACGGATCCAACGTCCGCAArGTGTTATTAAG 8581 nt pbi8 CACAAGCTTGCCCGTCTCACTGGTGA 8535 nt Рис. 1. Схема мест посадки праймеров в конструкции, использованной для создания трансгенных растений, созданной на основе плазмиды pBI121. Область Т-ДНК (T-DNA) выделена светло-серым цветом. Обозначения: nptll - ген неомицинфосфотрансферазы II Escherichia coli; TG - целевой ген; LB, RB - повторы, окаймляющие Т-ДНК; 0 - ori репликации; BD1/2, BD3/4, BD5/6, BD7/8, BD9/10 - праймеры на векторные последовательности; pbi1, pbi2, pbi3, pbi4, pbi5, pbi6, pbi7, pbi8 - праймеры для секвенирования; npt1/2 - праймеры на ген неомицинфосфотрансферазы II Escherichia coli [Fig. 1. Location of the primers in the construction used for generating transgenic plants produced on the basis of the plasmid pBI121. T-DNA region is colored light gray. Abbreviations: nptll, gene encoding Escherichia coli neomycin phosphotransferase II; TG - target gene; LB and RB, the repeats encompassing T-DNA; 0, ori; BD1/2, BD3/4, BD5/6, BD7/8, and BD9/10 are primers for vector sequences; pbi1, pbi2, pbi3, pbi4, pbi5, pbi6, pbi7, and pbi8 are primers for sequencing; and; npt1/2, primers for Escherichia coli neomycin phosphotransferase II] Амплификация осуществлялась в следующем режиме: денатурация 3 мин при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 60°С, элонгация 1 мин при 72°С для первых 3 циклов, затем денатурация 30 с при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 62°С, элонгация 1 мин при 72°С для последующих 32 циклов. Все амплификации проводились в программируемом амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК Технология». Для того чтобы исключить присутствие в анализируемых образцах почвенной бактерии A. tumefaciens, дополнительно использовали праймеры на фрагмент ДНК A. tumefaciens. Реакционная смесь объемом 15 мкл имела состав, аналогичный составу, описанному для ПЦР с праймерами на векторные последовательности. Амплификация осуществлялась в следующем режиме: 1 цикл денатурация 3 мин при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 64°С, элонгация 1 мин при 72°С, следующие 3 цикла, затем денатурация 40 с при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 64°С, элонгация 1 мин при 72°С и затем денатурация 40 с при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 62°С, элонгация 1 мин при 72°С для последующих 28 циклов. Разделение продуктов ПЦР-реакции проводилось путем электрофореза в 6%-ном акриламидном геле. Был выбран полиакриламидный гель, поскольку он является более подходящим, чем агарозный, для разделения фрагментов ДНК, близких по длине. Для уточнения взаиморасположения фрагментов векторной ДНК относительно Т-ДНК у растений моркови № 33/2 и № 106 участки векторной ДНК были секвенированы. Клонирование и секвенирование фрагментов векторной ДНК проводилось методом «инвертированной» ПЦР [21]. Для секвенирования геномную ДНК трансгенных растений (100-200 нг) гидролизовали эндонуклеазами рестрикции TaqI, MspI, Bsp19I или EcoRI, смесь экстрагировали фенолом. ДНК растворяли в лигазном буфере (50 мМ Tris-HCl рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотрейтол, 1 мМ ATP) (1-2 нг/ мкл) и подвергали самолигированию в течение ночи при температуре 8°C. ДНК осаждали этанолом, растворяли в воде и использовали в качестве матрицы для ПЦР. ПЦР проводили в 50 мкл буфера, содержащего 67 мМ Tris-HCl (pH8,9), 16 мМ (Nh4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween 20, 10 мМ Р-меркаптоэтанола, 100 мкМ dNTP, 1 мкМ праймеров, 2 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификацию осуществляли в течение 32 циклов в следующем режиме: денатурация 1 мин при 94°С, отжиг праймеров 1 мин при 52°С для первого цикла и 30 с при 62°С для всех последующих циклов, элонгация 3 мин при 72°С. Далее 1/10 амплификационных смесей использовали для второго раунда амплификации с «внутренними» праймерами в аналогичных условиях ПЦР. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов ДНК определяли с использованием «ABI PRISM Big Dye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit» (Amersham, UK). Полученные с помощью секвенирования последовательности ДНК были проанализированы методом BLAST по базе данных GenBank. Результаты исследования и обсуждение Результаты нашего исследования показали, что вследствие ошибок про-цессинга Т-ДНК в геном трансгенных растений переносятся различные фрагменты векторной ДНК. Фрагменты могут быть как совсем небольшими (300-400 пн), так и включать в себя всю векторную последовательность целиком (8 600 пн для плазмиды pB121). На рис. 2 представлена электро-фореграмма разделения продуктов амплификации геномной ДНК трансгенных растений моркови. В каждой реакции амплификации участвовало одновременно три пары праймеров - праймеры на ген nptii, праймеры на ген экстенсина (хозяйский ген из генома моркови) и одна из пар праймеров на векторную последовательность. Продукты амплификации, обозначенные на дорожках буквой а, соответствуют маркерному гену nptll, что свидетельствует о трансгенном статусе анализируемых растений. Фрагменты геномной ДНК, обозначенные на дорожках буквой b, соответствуют гену экс-тенсина, что подтверждает наличие в образцах геномной ДНК из растений моркови. Продукты амплификации, обозначенные буквами c, d, e, f g; соответствуют фрагментам векторной ДНК: c - фрагменту BD1/2; d - фрагменту BD3/4; e - фрагменту BD5/6; f - фрагменту BD7/8 и g - фрагменту BD9/10. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1000 500 soo 700 600 500 400 МО 200 2 f I j Шш toll /e ar w M -* 1 MM \

Скачать электронную версию публикации