Variability in the accumulation of hepatitis B virus S antigen in storage roots and leaves of individual transgenic carr.pdf Введение Для вакцинации против вирусного гепатита В человека используется поверхностный рекомбинантный антиген HBsAg, синтезируемый клетками дрожжей (Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris). Несмотря на антигенную и иммунологическую эквивалентность белков (рекомбинантного и белка, выделенного из сыворотки носителей вируса гепатита В), вакцина, полученная в дрожжевой системе экспрессии, не лишена недостатков и требует ее дальнейшего улучшения. HBsAg входит в состав белков оболочки вирусной частицы, его образование кодируется геном env. С нуклеотидной последовательности этого гена за счет особенностей организации рамки считывания синтезируется три белка, являющихся компонентами белковой оболочки вируса: короткий (S, или HBsAg), средний (M, или preS2-HBsAg) и большой (L, или preS1-preS2-HBsAg). Все три белка, входящие в состав вирусной оболочки, обладают им-муногенными свойствами и используются при разработке рекомбинантных вакцин. Использование для иммунизации двух или всех трех поверхностных антигенов одновременно приводит к повышению иммуногенности вакцинного препарата [1, 2]. S-, M- и L-антигены обычно производятся в системах экспрессии на основе дрожжей [3] или клеток млекопитающих [2, 4]. Тревожная ситуация, сложившаяся в связи с распространением вируса гепатита В не только в нашей стране, но и в мире, вызванная многими причинами, в том числе и проблемами в области профилактики, стимулировала исследования по созданию недорогих широко доступных и эффективных вакцин. В настоящее время генетически модифицированные растения рассматриваются как перспективная альтернативная экспрессионная платформа для получения рекомбинантных белков медицинского назначения, в том числе и для получения вакцинных белков, в частности рекомбинантных антигенов вируса гепатита В. Первым антигеном, полученным в растительной системе экспрессии для вакцинации человека в виде инъекций, а также для пероральной иммунизации, был S-антиген вируса гепатита В [5-7]. Для увеличения выхода рекомбинантного белка в стабильной системе экспрессии, т.е. при интеграции чужеродного гена в ядерный или хлоропластный геномы растения, исследователями использовались как активные промоторы, так и различные генетические элементы, усиливающие экспрессию целевого гена. Положительный эффект в усилении экспрессии S-HBsAg в растительных клетках был связан с общим типом метаболизма клеток [8]. Например, относительно высокое содержание S-HBsAg-иммуногена наблюдалось в суспензионных культурах клеток, в которых антиген секретировался в среду для культивирования [9]. Хорошо охарактеризованный конститутивный промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV), обеспечивающий транскрипцию молекулы 35S РНК CaMV и называемый соответственно P35S [10], широко используется в экспериментах по созданию трансгенных растений. CaMV35S-промотор обеспечивает достаточно высокий уровень экспрессии трансгена у двудольных растений и несколько менее эффективен у однодольных [11, 12]. По данным некоторых исследователей, эффективность промотора CaMV35S в обеспечении высокого уровня экспрессии трансгена не всегда одинакова во всех клетках и тканях трансгенного растения [13, 14]. Известно, что при агробактериальной трансформации растений интеграция целевых генов в составе генетической конструкции происходит случайным образом в различные участки разных хромосом, поэтому каждое трансгенное растение индивидуально по месту встройки и числу встроенных копий трансгена [15]. Установлено, что уровень экспрессии трансгена, находящегося под контролем CaMV35S, может значительно варьировать у разных трансгенных растений, полученных в одном эксперименте. Таким образом, уровень экспрессии трансгена часто зависит от его положения в растительном геноме (близость или удаленность от сильных промоторов, усилителей или глушителей транскрипции и т.п.), метилирования ДНК и модификации гистонов в области промотора [14, 16-19]. С развитием методов геномного и транскриптомного анализов экспериментально было установлено, что экспрессия большого числа генов в разных органах (например, в листьях и корнях) одного и того же растения, как правило, существенно различается [20-22]. Полученные данные о различиях в накоплении транскриптов одних и тех же генов, экспрессирующихся в разных тканях растения, наводят на мысль о различиях в уровне накопления рекомбинантных белков в разных органах и тканях среди индивидуальных трансгенных растений. Однако данные о том, как индивидуальные трансгенные растения различаются по относительному уровню синтеза рекомбинантного белка в разных органах и тканях растения, в имеющейся доступной литературе весьма малочисленны. В связи с этим целью данного исследования послужил сравнительный анализ накопления HBsAg-антигена в различных органах - корнеплодах и листьях индивидуальных трансгенных растений моркови, несущих ген, кодирующий S-белок, под контролем промотора CaMV35S. Материалы и методики исследования В качестве бинарного вектора для трансформации растений использовали плазмиду pBINPLUS/ARS (рис. 1, а), любезно предоставленную Dr. R.W. Hammond (USDA, USA). По сайтам эндонуклеаз рестрикции HindIII-Acc65I в состав pBINPLUS/ARS встраивали кодирующую последовательность HBsAg (GenBank V00867.1), находящуюся под контролем промотора CaMV35S (435 п.н.) и ограниченную с 3'-конца последовательностью сигнала полиаденилирования мРНК CaMV (polyA, 202 п.н.) (рис. 1, b) [23]. Трансформацию клеток моркови (Daucus carota L.) проводили методом агробактериального переноса. В качестве эксплантов использовали эмбрио-генный каллус, индуцированный из зрелых зародышей моркови сорта Нант-ская 4. Ночную культуру Agrobacterium tumefaciens, плотностью 1 о.е. при 600 нм, предварительно разбавляли средой MS в соотношении 1:3. После ко-культивирования с агробактерией в течение 3 сут в темноте и при температуре 22°С экспланты переносили на среду MS с добавлением 0,2 мг/л ки-нетина и 0,2 мг/л 2,4-Д, содержащую 500 мг/л цефотаксима для подавления роста агробактерии и 100 мг/л канамицина в качестве селективного агента. Пассирование каллусов на свежую среду аналогичного состава проводили каждые 3-4 нед до начала эмбриогенеза. Хорошо сформировавшиеся эмбри-оиды с развивающейся первой листовой пластинкой переносили на безгормональную среду MS с канамицином (100 мг/л) и цефотаксимом (500 мг/л) для развития трансгенных растений-регенерантов. Растения с хорошо развитой корневой системой и розеткой листьев выращивали в условиях теплицы на гидропонной культуре при освещенности 20 тыс. лк, световом периоде 18/6 часов и суточных колебаниях температуры 18-25°С [24]. Геномную ДНК растений выделяли по стандартной методике [25]. Наличие перенесенного гена в геномной ДНК растений моркови подтверждали ПЦР с использованием пары праймеров (см. рис. 1, b, указано стрелками): S1 5CCG-CAAATCACCAGTCTCT3' и S2 5GGGTAACGCCAGGGTTTT3\ ПЦР проводили в 10 мкл буфера, содержащего 67 мМ трис-HCL (pH 8,9), 16 мМ (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween 20, 10 мМ Р-меркаптоэтанола, 200 мкМ dNTP, 10 пМ праймеров, 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («Биосан», г. Новосибирск) с использованием амплификатора «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: первый цикл: 95°С - 3 мин; пять циклов 95°С - 10 с, 63°С - 10 с, 72°С - 18 с; двадцать восемь циклов 95°С -10 с, 62°С - 10 с, 72°С - 18 с. Электрофорез проводили в 1,5% агарозном геле в ^TAE буфере. Белковые экстракты из тканей растений получали по ранее описанному методу [6] с небольшой модификацией: 1 г листьев или корнеплода моркови (отдельно для каждого растения) растирали в ступке с жидким азотом. Навеску полученного порошка (500 мг) помещали в 1,5 мл пробирку и добавляли 500 мкл дистиллированной воды. Эту смесь инкубировали в течение одного часа на шейкере при комнатной температуре, затем оставляли на ночь при температуре +4°С для экстракции. Экстракт центрифугировали 30 мин с ускорением 16 000 об/мин, супернатант ресуспендировали и вновь центрифугировали 40 мин с ускорением 20 000 об/мин на центрифуге Bekman J2-21 (США), ротор JA-20. Полученный супернатант анализировали методом ИФА на наличие HBsAg, используя набор «Вектогеп B-HBs-антиген D-0556» («Вектор-Бест», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Экстракцию белка из тканей одних и тех же растений проводили независимо дважды, с интервалом 2 дня. Между анализами образцы растений хранили при +4°С. Для сравнительного анализа содержания HBsAg в тканях различных органов (листья и корнеплоды) из 27 трансформантов было отобрано 13 трансгенных растений моркови, в экстрактах из которых был обнаружен целевой белок. Используемые в работе олигонуклеотиды синтезированы в ЦКП по синтезу олигонуклеотидов и их аналогов (ИЦИГ СО РАН). Работы по определению первичной структуры последовательностей ДНК выполнены в ЦКП «Геномика» СО РАН (г. Новосибирск). Генетически модифицированные растения моркови выращивали в ЦКП «Лаборатория искусственного выращивания растений» (ИЦИГ СО РАН, г. Новосибирск). Статистическая обработка материала и построение графика проведены с помощью программы Microsoft Excel 2010. ►I.......fiiiipf EcoRI HS3J ilffll (Кб) Sam HI (iufi) а fjrrtdlll(a) CaMVp35S polyA -irt-csi (1323) b Рис. 1. Схема бинарного вектора pBINPLUS/ARS и целевого фрагмента: а - структура бинарного вектора для агробактериальной трансформации растений pBINPLUS/ARS [26]. RB и LB - концевые повторы Т-ДНК плазмиды Ti; oriV, ori CoLE1; RP(trfA) (relaxosome protein RP) - генетические элементы плазмиды с широким кругом хозяев; nptIII - ген устойчивости к канамицину (белок аминогликозид 3' фосфотрансфераза), функционирующий в бактериях; P1ubi-UQ-nptII-Tubi -гибридный ген ubiquitin-NPTII, экспрессирующийся в растениях и обеспечивающий устойчивость к канамицину; P1ubi, Tubi - промотор и терминатор гена ubi, кодирующего убиквитин; lacZ - структурный ген лактозного оперона, генетический элемент, позволяющий проводить цветовую селекцию колоний. b - фрагмент ДНК 1328 пн, который встраивали в вектор pBINPLUS/ARS по сайтам HindIII-Acc65I, p35S - последовательность промотора P35S; S - последовательность ДНК, кодирующая HBsAg; стрелками указаны места, комплементарные праймерам S1 и S2 (см. текст) [Fig. 1. Scheme of the binary vector pBINPLUS/ARS and the target fragment: a - the structure of the binary vector for agrobacterium-mediated plant transformation pBINPLUS/ARS [26]. RB and LB are terminal repeats in the T-DNA plasmid Ti; oriV, ori CoLE1; RP(trfA) (relaxosome protein RP) are plasmid genetic elements with a broad host range; nptIII is kanamycyn resistance gene (Aminoglycoside 3'-phosphotransferase) functioning in bacteria; P1ubi-UQ-nptII-Tubi is ubiquitin-NPTII hybrid gene expressed in plants and providing resistance to kanamycin,; P1ubi, Tubi are ubi gene promoter and terminator, encoding ubiquitin; lacZ is a structural gene of the lac operon , genetic element, allowing to carry out color selection of colonies. b - the 1328 bp DNA fragment which was inserted into pBINPLUS/ARS vector at HindIII-Acc65I sites, p35S is P35S promoter sequence; S is DNA sequence encoding HBsAg; the arrows indicate places complimentary to S1 and S2 primers (see the text)] Результаты исследования и обсуждение В результате агробактериальной трансформации было получено 27 трансгенных растений моркови, содержащих последовательность гена, кодирующего короткий S-белок, или HBsAg вируса гепатита В, находящуюся под контролем конститутивного промотора CaMV35S. Трансгенный статус полученных трансформантов подтверждали методом ПЦР (рис. 2). 12 3 4 5 6 7 В 9 10 11 12 710 Рис. 2. ПЦР-анализ трансгенных растений моркови, содержащих последовательность ДНК, кодирующую HBsAg, в 2% агарозном геле. 1-10 трансгенные растения, содержащие целевой ген; 11 - положительный контроль (плазмидная ДНК); 12 - маркер длин фрагментов ДНК плазмиды pBluescriptSK(+)/ MspI. [Fig. 2. PCR analysis of transgenic carrot plants containing DNA sequence encoding HBsAg, in 2% agarose gel. 1-10 - are transgenic plants containing a target gene; 11 - is positive control (plasmid DNA); 12 - is length marker of pBluescriptSK(+)/ MspI plasmid DNA fragments] Присутствие на фореграмме полос на дорожках 1-10, размер которых соответствовал ожидаемому, свидетельствовало о наличии целевой последовательности в геноме исследуемых растений моркови. Из 27 белковых экстрактов растений были выбраны 13, содержащие по данным ИФА целевой белок в детектируемых ИФА количествах. Результаты сравнительного анализа накопления HBsAg как в листьях, так и в корнеплодах индивидуальных трансгенных растений представлены на рис. 2. Среднее содержание исследуемого рекомбинантного антигена в листьях составило 9,43 нг/г сырой массы и в корнеплодах - 4,57 нг/г. Между индивидуальными растениями наблюдалась вариабельность в накоплении HBsAg как в листьях, так и в корнеплодах. Изменчивость по накоплению анализируемого антигена составила от 0,1 до 20,69 нг/г сырой массы в тканях листьев и от 0,34 до 12,07 нг/г в тканях корнеплодов исследуемых трансгенных растений моркови (см. рис. 2). Как видно из представленных на рис. 3 данных, при сравнении индивидуальных растений моркови наблюдаемая вариабельность HBsAg не была равнозначной по его накоплению в тканях корнеплодов и листьев, т.е. высокий уровень антигена в листьях не соответствовал таковому в корнеплодах, и наоборот. Несмотря на то, что последовательность гена, кодирующего HB-sAg в составе генетической конструкции, находилась под управлением конститутивного CaMV35S-промотора, обеспечивающего экспрессию трансгена во всех тканях трансгенного растения, по результатам сравнительного анализа среди исследуемых растений нами выделены три группы. 25 т-■ Номера растений ■ листья корнеплоды [Leavesl [Storage rootsl Рис. 3. Содержание HBsAg в листьях и корнеплодах трансгенных растений моркови (нг/г сырой массы): 1-36 - номера выбранных трансгенных растений [Fig. 3. HbsAg concentration in leaves and storage roots of transgenic carrot plants (ng/g fresh weight). 1-36 are selected transgenic plants. On the Y-axis - HbsAg concentration; on the X-axis - Numbers of selected transgenic plants] В первую группу вошли только два растения (№ 3 и 25), у которых соотношение между накоплением HBsAg-антигена в листьях и корнеплодах было близко к равнозначному. Ко второй группе были отнесены растения, у которых количество HBsAg в листьях превышало количество этого антигена, выявляемое в корнеплодах (№ 1; 7; 8; 15; 20; 22; 31 и 36). У растений третьей группы накопление HBsAg в корнеплодах преобладало в пользу его накопления в листьях (№ 4; 16 и 28). Удобными моделями для выявления особенностей экспрессии чужеродных генов под управлением различных промоторов, как тканеспецифичных, так и конститутивных, являются трансгенные растения, в геном которых интегрированы репортерные гены, такие как gfp, кодирующий зеленый флюоресцирующий белок, или uidA, кодирующий фермент бета-глюкуронидазу. На основании сравнительного анализа активности бета-глюкуронидазы, синтезируемой в различных органах и тканях у разных видов трансгенных растений, установлено, что в листьях трансгенных растений табака CaMV 35S-промотор обеспечивает более высокую экспрессию uidA-гена по сравнению с листьями трансгенных растений люцерны, канолы или Arabidopsis thaliana [27]. Отмечена вариабельность по активности бета-глюкуронидазы в различных тканях трансгенных растений табака - в листьях и стеблях активность фермента была значительно выше, чем в цветках и семенах [26, 27]. У трансгенных растений люцерны высокая активность фермента бета-глюкуро-нидазы наблюдалась в листьях, стеблях и корнях, однако CaMV 35S-промотор не был активен в клетках кортикального слоя корней и в симбиотической зоне корневых волосков, где активность фермента не детектировалась [28]. У трансгенных растений моркови с геном uidA под контролем CaMV35S-промотора, а также «двойного» CaMV35S-промотора активность фермента бета-глюкуронидазы была выше в листьях по сравнению с корнеплодами [29]. Полученные нами данные о соотношении среднего количества целевого белка в листьях и корнеплодах трансгенных растений моркови в целом хорошо согласуются с данными Уэлли и соавт. [29]. Однако при оценке индивидуальных трансгенных растений выявляются некоторые несоответствия в соотношениях средних количеств HBsAg между анализируемыми органами растения. Выявленные несоответствия, вероятнее всего, отражают эффект положения трансгена в геноме трансгенного растения, связанный с тем, что тканеспеци-фичные промоторы генов из геномного окружения области инсерции трансгена могли модулировать активность CaMV35S-промотора. Возможность изменения активности промоторов растительных генов в районе интеграции uidA-гена под управлением CaMV35S-промотора продемонстрирована в исследованиях Женг и соавт. [30]. Полученные в данной работе результаты подчеркивают необходимость проведения селекции наиболее продуктивных по целевому белку трансгенных растений по результатам анализа накопления этого белка в соответствующих целевых для технологической переработки тканях/органах растения (например, в корнеплодах моркови, плодах томатов, зернах риса), а не в листьях проростков, что обычно осуществляется на ранних этапах изучения получаемых трансгенных растений. Заключение Проанализировано накопление HBsAg в листьях и корнеплодах трансгенной моркови. Обнаружена вариабельность в уровне накопления этого антигена как в листьях, так и в корнеплодах исследованных растений. Кроме того, нами не обнаружена прямая корреляции между уровнем накопления целевого белка в листьях и корнеплодах индивидуальных растений.

Скачать электронную версию публикации