Cytogenetic peculiarities of Larix sibirica Ledeb. embryogenic cell lines in in vitro culture.pdf Введение Соматический эмбриогенез - вегетативный способ массового тиражирования растений, позволяющий существенно ускорить генетико-селек-ционные исследования и увеличить масштабы получаемого посадочного материала важных лесохозяйственных объектов с селекционно-значимыми признаками. Это особенно актуально для медленно растущих хвойных растений. Известно, что условия культуры, продолжительность культивирования, применение регуляторов роста могут приводить к различным изменениям в кариотипе растений, в частности к увеличению частоты мутаций [1]. Для успешного размножения хвойных через соматический эмбриогенез необходимо проводить оценку генетической стабильности полученных эм-бриогенных культур. В литературе данные по генетической стабильности эмбриогенных культур хвойных растений противоречивые. Изменение числа хромосом отмечалось в эмбриогенных культурах некоторых видов хвойных, в частности Abies alba [2], Pinus nigra [3], Larix x eurolepis [4], Pinus radiatct [5]. Ане-уплоидия и несколько вариантов хромосомного мозаицизма выявлены в клеточных культурах и полученных из них клонах Picea mariana, P. glauca, P. abies [6, 7]. В то же время другими авторами показана генетическая стабильность P. abies в культуре in vitro [8-10]. В настоящей работе приводятся результаты цитогенетического исследования эмбриогенных клеточных линий лиственницы сибирской (Larix sibiri-ca Ledeb.) разной продолжительности культивирования из коллекционного банка эмбриогенных культур лаборатории лесной генетики и селекции Ин-статута леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (г. Красноярск). Цитогенетический контроль проводился с целью оценки уровня генетической стабильности клеточных линий в зависимости от длительности культивирования и, следовательно, определения качества получаемых растений-регенерантов. Материалы и методики исследования Для проведения цитогенетических исследований из коллекционного банка эмбриогенных культур лиственницы сибирской [11] отобраны три разновозрастные длительно пролиферирующие эмбриогенные клеточные линии: КЛ 5, КЛ 6 и КЛ 16.28. Для получения данных клеточных линий от дерева-донора А4 в культуру вводились зиготические зародыши, полученные в результате свободного опыления (КЛ 6 в 2011 г., КЛ 16.28 в 2016 г.), а также контролируемого опыления пыльцой лиственницы Сукачева (КЛ 5 в 2009 г.). Возраст опытных деревьев составляет 50-70 лет, все они произрастают в дендрарии Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (г. Красноярск, Академгородок). Контролируемое опыление лиственницы сибирской с целью получения материала для ввода в культуру in vitro (зиготических зародышей) проводили в конце третьей декады апреля - в период созревания микростробилов и начала пыления. Введение в культуру, инициация и пролиферация эмбриогенных культур у лиственницы сибирской проводились на среде АИ (патент 2456344; http://www.freepatent.ru/images/patents/5/2456344/patent-2456344.pdf) и описывались в работах авторов статьи ранее [11, 12]. Пролиферирующие эмбриогенные культуры субкультивировали на свежую питательную среду АИ через каждые 14 дней. Культуры инкубировали в темноте при температуре (24 ± 1)°С. Продуктивность эмбриогенных клеточных линий оценивали путем подсчета числа соматических зародышей в 1 г сырой эмбрионально-суспензорной массы через неделю после пересадки. Величина выборки составляла 25-30 для каждой клеточной линии. Цитогенетический анализ глобулярных соматических зародышей проводили на этапе пролиферации с использованием существующих методик кариологического и цитогенетического исследования растений [13, 14] с собственными модификациями. При анализе хромосомных чисел использовались разные варианты обработки материала для сокращения хромосом и разрушения веретена деления. Наилучшие результаты для большинства клеточных линий получены при обработке материала 0,2%-ным раствором колхицина в течение 18-20 ч при комнатной температуре. Материал фиксировали спиртово-уксусной смесью (3:1) в течение 24 ч. Часть материала фиксировали без обработки колхицином для анализа ми-тотических делений. Перед окраской небольшой кусочек эмбрионально-су-спензорной массы отмывали от фиксатора, протравливали 2-4 мин в 4%-ном растворе железоаммонийных квасцов, затем помещали в 1%-ный раствор ацетогематоксилина и окрашивали в термостате при 50°С в течение 1015 мин. Затем с помощью препаровальной иглы и пинцета отделяли несколько соматических зародышей, помещали их в каплю насыщенного раствора хлоралгидрата и мацерировали лезвием бритвы 2-3 мин до получения однородной суспензии. Фильтровальной бумагой убирали излишек жидкости и готовили давленый препарат стандартным способом. Просмотр препаратов осуществляли при помощи микроскопа «МИКМЕД-6» («ЛОМО», Россия) и цифровой камеры МС-12 («ЛОМО», Россия). Число хромосом определяли не менее чем в 100 метафазных пластинках для каждой клеточной линии. Результаты исследования и обсуждение Пролиферирующая эмбриогенная культура хвойных представляет собой полупрозрачную массу незрелых соматических (глобулярных) зародышей -эмбрионально-суспензорную массу (embryonal suspensor masses - ЭСМ), или волокнистый зародыш (filamentous embryos) [15]. В ЭСМ лиственницы сибирской обнаруживались полиэмбриональные комплексы, состоящие из нескольких эмбрионов, наряду с самостоятельными отдельными зародышами. Клеточные деления локализованы в глобулах зародышей. В эмбриогенной культуре постоянно происходит мультипликация зародышей [16], этим объясняется тот факт, что зародыши находятся на разных стадиях развития и представляют собой глобулы размером от двух до нескольких десятков клеток. Используемые в работе разновозрастные эмбриогенные клеточные линии лиственницы сибирской (КЛ 5, КЛ 6 и КЛ 16.28) отличались между собой по жизнеспособности, пролиферативной активности, по числу соматических зародышей, их размерам и способности созревать. Длительно пролиферирующие КЛ 5 и КЛ 6 сохраняли эмбриогенный потенциал в течение 8 и 6 лет соответственно и характеризовались массовым образованием соматических зародышей. Подобная пролиферативная активность эмбрио-генных культур описана ранее в культуре мегагаметофитов Larix decudua и культуре зародышей гибридов лиственницы L. х eurolepis и L. х marschlinsii [17, 18], где образование ЭСМ шло в течение 9-17 лет. Цитологический анализ показал, что при одинаковых условиях культивирования в одних клеточных линиях лиственницы сибирской происходит более активное образование соматических зародышей, чем в других. Так, продуктивность КЛ 6 составляла 2 040 ± 189 шт./г ЭСМ, однако количество созревающих соматических зародышей не превышало 0,6%. Гибридная КЛ 5 формировала большее число соматических зародышей 3 750 ± 163 шт./г ЭСМ, однако все они не созревали. В норме кариотип лиственницы сибирской содержит 24 хромосомы (2n = 2x = 24): шесть пар длинных метацентриков и шесть пар коротких субметацентриков [19-23]. Как и у других хвойных, число хромосом у лиственницы сибирской характеризуется высокой степенью стабильности, геномные мутации наблюдаются редко и представлены главным образом единичными полиплоидными клетками. Эмбриогенные клеточные линии лиственницы сибирской различались по цитогенетической стабильности и числу хромосом. Две клеточные линии (КЛ 6 и КЛ 16.28) являлись диплоидными и содержали преимущественно клетки с нормальным для данного вида числом хромосом 2n = 24 (рис. 1). Если продолжительность культивирования КЛ 16.28 составляет менее одного года, то КЛ 6, вероятно, сохраняет цитогенетическую стабильность в течение всех 6 лет культивирования. Генетическая стабильность данной линии показана ранее с помощью микросателлитного анализа: несоответствие материнскому генотипу по двум аллелям наблюдалось только в одном из девяти локусов [24]. От КЛ 6 получены клонированные сеянцы лиственницы сибирской, которые успешно растут в теплице ОЭХ «Погорельский бор» - стационара Института леса СО РАН [11]. Эти клоны, по данным микросателлитного анализа, показали полную идентичность КЛ 6, от которой получены [24]. В исследованных образцах КЛ 6 и КЛ 16.28 выявлены геномные мутации, представленные отдельными клетками, содержащими измененный набор хромосом (таблица). Единичные клетки содержали редуцированное число хромосом (2n = 10, 20), вероятно, их появление связано с нарушениями митоза. Также отмечены полиплоидные клетки: более «молодая» КЛ 16.28 содержала их в количестве 3,5%, тогда как у КЛ 6 этот показатель составил уже 9,0% (см. таблицу). Хромосомная мутация выявлена только у КЛ 6 и представлена единственной клеткой с ацентрическим кольцом. Гибридная КЛ 5, полученная в 2009 г., отличалась цитогенетической нестабильностью и значительным разбросом чисел хромосом (см. таблицу). Большая часть метафазных пластинок (31,2%) содержала 29 хромосом, из которых 15 являлись длинными метацентриками и 14 - короткими субмета-центриками (рис. 1, e, f). Частота встречаемости метафазных пластинок с различным числом хромосом у клеточных линий лиственницы сибирской [Frequency of occurrence of metaphase plates with a different number of chromosomes in the Siberian larch cell lines] Число хромосом (2n) [Chromosome number (2n)] Процент клеток с аномальным Клеточная линия [Cell line] 24 10 20 25 26 27 28 29 30 35 48 54 X числом хромосом [Percentage of cells with an abnormal chromosome number] КЛ 5 [CL 5] 1 - - 7 10 18 18 35 20 1 1 1 112 99 КЛ 6 [CL 6] 91 9 - 100 9 КЛ 16.28 [CL 16.28] 107 1 1 4 - 113 5 W >ы /л\ / '1 -««■ ' 1 Ф A d А e Рис. 1. Метафазные пластинки с разным числом хромосом у эмбриогенных клеточных линий L. sibirica: а - 2n = 24 (КЛ 6); b - КЛ 2n = 24 (16.28); c - 2n = 25 (КЛ 5); d - 2n = 28 (КЛ 5); е, f - 2n = 29 (КЛ 5). Окрашивание 1%-ным ацетогематоксилином [Fig. 1. Metaphase plates with a different number of chromosomes in embryogenic cell lines of L. sibirica: а - 2n = 24 (CL 6); b - CL 2n = 24 (16.28); c - 2n = 25 (CL 5); d - 2n = 28 (CL 5); е, f - 2n = 29 (CL 5). Stained with 1% acetogematoxylin] Рис. 2. Патологии митоза и микроядра в клетках эмбриогенных культур L. sibirica (КЛ 5): а - мост и фрагмент в анафазе; b - выброс хромосом и их фрагментов в метафазе; c - отстающая хромосома в анафазе; d - К-митоз; e - хаотическое расхождение хромосом в анафазе; f - микроядро, сохраняющееся в метафазе митоза; g-i - микроядра разной формы. Окрашивание 1%-ным ацетогематоксилином. Масштабная линейка 10 мкм [Fig. 2. Pathologies of mitosis and micronuclei in cells of embryogenic cultures of L. sibirica (CL 5): а - Bridging and fragment in anaphase; b - Chromosomes and fragments outside of spindle division in metaphase; c - Lagging chromosomes in anaphase; d - C-mitosis; e - Random chromosome segregation in anaphase; f - Micronucleus, remaining in the metaphase of mitosis; g-i - Micronuclei of different shapes in cells. Stained with 1% acetogematoxylin. Scale 10 ^m] Также обнаружены клетки, содержащие 24, 25, 26, 27, 28, 30, 35 хромосом. Цитогенетическая нестабильность данной клеточной линии может быть связана как с аномалиями, присутствовавшими в материале, использованном для введения в культуру, так и с адаптацией клеток к условиям культуры in vitro. Поскольку исследование числа хромосом данной клеточной линии проводится впервые, невозможно установить достоверно, на каком этапе появились аномалии. Анализ митоза показал, что наибольшее количество патологий наблюдается на стадии метафазы - 24,5% от общего числа клеток на данной стадии. В спектре нарушений преобладают хаотическое расхождение хромосом в метакинезе, преждевременное расхождение или выбросы отдельных хромосом. На стадии анафазы наблюдались трехполюсное и хаотическое расхождение, отставание и забегание отдельных хромосом. Патологии, связанные с повреждением хромосом, - мосты, фрагментация и агглютинация хромосом - наблюдались реже и составляли 2,1% от общего числа делящихся клеток. Некоторые типы патологий представлены на рис. 2. Общее количество клеток с патологиями в митозе составило 13,2%, что значительно превышает уровень естественного мутагенеза, характерный для соматических клеток хвойных растений [25]. В интерфазных клетках КЛ 5 наблюдались микроядра различной формы (рис. 2, f-i), частота встречаемости таких клеток составляла 10,5%. Наиболее часто встречались микроядра «стандартного» вида [26] - небольшие по размеру, хорошо оформленные округлые образования ядерного материала, расположенные в цитоплазме клетки на некотором удалении от основного ядра. В некоторых случаях обнаруживались микроядра «прикрепленного» вида [26], соединенные с основным ядром тонкой нитью (рис. 2, g, i). Интересно, что микроядра наблюдались и в делящихся клетках на разных стадиях митоза, количество таких клеток варьировало от 9,0 (анафаза) до 17,7% (профаза). Микроядра могут быть образованы как целой хромосомой при повреждении веретена деления, так и ацентрическим фрагментом хромосомы, возникшим в результате структурных патологий. По размерам микроядер можно судить об изменениях, произошедших в хромосомном наборе. В ряде работ убедительно показано, что наличие клеток с крупными микроядрами тесно связано с патологией митотического аппарата, а мелких - в основном со структурными аберрациями хромосом [27-29]. При этом обнаруживается прямая связь между содержанием крупных и центромер-позитивных микроядер [30]. Присутствие микроядер, как правило, свидетельствует о нарушении механизмов элиминации патологий митоза, значительном повреждении геномного материала клетки и генетической нестабильности [28]. Цитогенетическая нестабильность клеточной линии 5 может быть связана с ее гибридным происхождением, а также с длительным периодом культивирования. В литературе имеются данные о цитогенетической нестабильности эмбриогенных культур некоторых видов хвойных растений. Например, при соматическом эмбриогенезе отмечено появление полиплоидных клеток в культуре мегагаметофитов Larix decidua, однако колебание числа хромосом не приводило к потере способности зародышей созревать [17]. Большое количество анеуплоидных клеток (до 70%) наблюдалось в эмбриогенной культуре гибридного вида Larix х eurolepis [4]. У Pinus radiatа одна из исследованных клеточных линий содержала в кариотипе лишнюю хромосому, что подтверждено исследованием количества ДНК [5]. Сомаклональная изменчивость по числу хромосом обнаружена у растений Picea glauca, P. mariana и P. abies, полученных с помощью соматического эмбриогенеза [6, 7]. Авторы отмечают у данных видов как анеуплоидию (2n = 38), так и несколько вариантов хромосомного мозаицизма (2n = 24, 27, 36; 2n = 30, 39, 40, 55). Заключение Полученные результаты показывают, что эмбриогенные клеточные линии лиственницы сибирской могут сохранять цитогенетическую стабильность в течение многих лет и успешно использоваться для получения растений-реге-нерантов и плантационного лесовыращивания. Однако для их выявления (отбора) необходимо проводить цитогенетический контроль клеточных линий коллекционного банка эмбриогенных культур. Цитогенетический анализ является наиболее чувствительным методом для выявления генетической стабильности клеточных линий, а также для определения качества получаемых растений-регенерантов. Кроме того, цитогенетические исследования эмбри-огенных клеточных линий вносят вклад в развитие теоретических аспектов генетики, репродуктивной биологии и биотехнологии хвойных. Авторы выражают благодарность д-ру биол. наук, проф., зав. лабораторией лесной генетики и селекции Е.Н. Муратовой (Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, Россия) и д-ру биол. наук, в.н.с Е.Д. Бадаевой (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Россия) за обсуждение полученных результатов исследования и ценные замечания.

Скачать электронную версию публикации