Влияние длительного субкультивирования на клональное микроразмножение Melissa officinalis L. и Origanum vulgare L. | Вестник Томского государственного университета. Биология. 2019. № 47. DOI: 10.17223/19988591/47/2

ГлавнаяАрхивВлияние длительного субкультивирования на клональное микроразмножение Melissa officinalis L. и Origanum vulgare L. | Вестник Томского государственного университета. Биология. 2019. № 47. DOI: 10.17223/19988591/47/2

Влияние длительного субкультивирования на клональное микроразмножение Melissa officinalis L. и Origanum vulgare L.

Изучена динамика морфометрических показателей развития эксплантов при длительном субкультивировании трех сортов Melissa officinalis L. (Цитронелла, Соборная, Крымчанка) и селекционного образца Origanum vulgare L. на втором этапе клонального микроразмножения. В качестве эксплантов на этом этапе использовали сегменты стебля с одним узлом, которые культивировали на питательной среде Мурасиге и Скуга, дополненной 0,5 мг/л БАП. Анализ морфогенеза эксплантов показал активное множественное побегообразование, при котором у мелиссы формировалось от 2,2 До 5,7, а у Душицы - от 9,5 До 54,8 побега на эксплант. При микроразмножении наблюдали образование корней у микропобегов (у мелиссы с частотой 44,4-92,7%) и формирование овоДненных микропобегов (у Душицы с частотой 16,7-44,5%). Частота этих процессов зависела от виДа или сорта и количества субкультивирований. Максимальные коэффициенты размножения у мелиссы сорта Цитронелла (До 12,0) отмечены в 3-5, а у Крымчанки (17,6) и Соборной (14,2) - в пятом субкультивировании. У O. vulgare наибольшее увеличение коэффициента размножения (До 74,1) выявлено в пятом пассаже, а в более позДних 12-13-м пассажах показано снижение этого показателя почти в 4 раза. Полученные Данные свиДетельствуют о возможности Длительного микроразмножения Душицы и мелиссы in vitro (как минимум, в течение 1-1,5 гоДа), при этом максимальная эффективность этого процесса отмечена в течение пятого субкультивирования.

The effect of long-term subcultivation on clonal micropropagation of Melissa officinalis L. and Origanum vulga.pdf Введение В последние годы наряду с использованием традиционных для юга России эфиромасличных и лекарственных растений (лаванды, шалфея, розы эфиромасличной, кориандра) проводится активное исследование и внедрение в производство новых видов, в том числе представителей семейства Lamiaceae Mart. - Melissa officinalis и Origanum vulgare [1]. Мелисса лекар- Влияние длительного субкультивирования на клональное размножение 23 ственная (Melissa officinalis L.) - многолетнее эфиромасличное, лекарственное и пряно-ароматическое растение, имеющее разнообразные области применения: в качестве медоноса, пряности, в медицине как седативное, спазмолитическое и иммуномодулирующее средство, антидепрессант [2, 3]. Сырье мелиссы входит в состав ароматических чаев. Душица обыкновенная (Origanum vulgare L.) - перспективное лекарственное, эфиромасличное и пряно-ароматическое растение, которое широко используется в парфюмерно-косметической и пищевой промышленности, медицине, а также в качестве фитобиотика в производстве комбикормов для животных [4]. В диком виде O. vulgare произрастает в европейской части России, в Южной Сибири, на Кавказе, а также во многих странах Западной Европы, в Турции, Индии и других регионах [2, 4]. В России, особенно в южных областях, довольно активно проводится заготовка сырья душицы, что может привести к истощению запасов и сокращению численности растений. Поэтому так же, как и у ряда других лекарственных растений, возникает проблема сохранения биоразнообразия и расширения, а порой и восстановления дикорастущих популяций вида. Вместе с тем мелисса и душица используются не только как лекарственные растения, но и как ароматические для получения эфирных масел [1]. Особую ценность имеет эфирное масло душицы, в состав которого входят тимол и карвакрол. Имеются данные о том, что эфирные масла с высоким содержанием карвакрола превосходят по свойствам многие существующие антибиотики и антигистаминные препараты [5, 6]. Поэтому в настоящее время все большее внимание уделяется созданию на основе эфирных масел фитобиотиков - аналогов синтетических антибиотиков, применение которых имеет ряд негативных последствий. В связи с низким содержанием эфирного масла в растительном сырье мелиссы и душицы в ФГБУН «НИИСХ Крыма» проводится работа по созданию высокомасличных сортов с повышенным содержанием ценных компонентов в составе эфирного масла [1, 7]. Интенсификация такого рода исследований связана с необходимостью ускоренного размножения полученных селекционерами ценных гибридов, мутантных форм, отобранных уникальных генотипов. Для решения разнообразных задач экологии, селекции и семеноводства во многих странах мира эффективно используются биотехнологические приемы. Одним из наиболее широко востребованных является метод клонального микроразмножения, позволяющий быстро размножить перспективные селекционные образцы и новые сорта, получить оздоровленный посадочный материал, создавать коллекции генетической плазмы in vitro [8]. Такие технологии разработаны для многих сельскохозяйственных и цветочно-декоративных растений [9, 10]. Однако в литературе встречаются немногочисленные данные, касающиеся разработки отдельных элементов методик клонального микроразмножения у разных видов мелиссы [11-13] и душицы [14-18]. Так, проведены исследования по оптимизации питатель -ных сред для основных этапов размножения in vitro [11, 13, 19], а также ис- 24 Н.А. Егорова, О.В. Якимова следования по укоренению и адаптации регенерантов M. officinalis [13, 20]. В качестве исходных эксплантов для микроразмножения мелиссы или душицы использовали меристемы [14, 17], пазушные или верхушечные почки [11, 19-21], но чаще - сегменты стебля с узлом [11, 18, 22-24]. В литературе имеются данные о том, что максимальное количество побегов на эксплант (3,2-4,1 шт.) у мелиссы развивалось при культивировании на питательной среде с 3,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) и 1,0 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) [20]. Греческие исследователи наибольшую частоту множественного побегообразования и число побегов (до 4 шт.) наблюдали при культивировании микропобегов M. officinalis на питательной среде с добавлением 1,0 мг/л кинетина и 0,5 мг/л БАП [11]. Ученые из Ирана у большинства из изученных 17 генотипов мелиссы отметили хорошую регенерацию микропобегов при использовании в составе питательной среды 2,0 мг/л БАП или 1,0 мг/л БАП с 0,5 мг/л ИМК [13]. Имеются работы по исследованию влияния происхождения донорного растения [14], типа экспланта [16, 18, 21] и питательных сред [15, 17, 21, 22] на развитие эксплантов на отдельных этапах микроразмножения представителей рода Origanum. Изучено влияние расположения пазушных почек на побеге донорного растения O. vulgare на их активацию in vitro и число микропобегов [23]. Количество формирующихся при клональном размножении микропобегов варьировало в зависимости от состава питательной среды, генотипа и используемых авторами методических подходов. Анализ развития микроклонов O. vulgare в течение 4, 8, 12 недель культивирования в цикле выращивания показал, что после 12 недель на разных питательных средах развивалось от 2,1 до 3,9 побега на эксплант [15]. Аргентинские исследователи сообщали о культивировании микрочеренков душицы обыкновенной на питательных средах, дополненных 0,28 мкМ БАП с 0,53 мкМ или 5,83 мкМ НУК, на которых коэффициент размножения составил 22,2 и 20,2 соответственно [14]. C.T. Oana et al. при использовании в составе питательной среды 1,0 мг/л БАП и 0,05 мг/л НУК получили высокую частоту множественного побегообразования (85,0%), при этом из одного микрочеренка формировалось 12,0 побега до 5,0 см длиной [21]. По данным D. Ozkum, на втором этапе клонального микроразмножения O. minutiforum лучшие результаты также достигнуты при использовании в составе питательной среды БАП (2,0 мг/л) и НУК (0,1 мг/л) [18]. В других исследованиях наибольшее количество побегов на втором этапе микроразмножения у О. sipyleum (до 7,8 шт. на эксплант) [17] и O. majorana (до 18,7 шт. на эксплант) [25] формировалось на среде МС, дополненной 1,0 мг/л БАП. Тем не менее многие вопросы клонального микроразмножения M. officinalis и O. vulgare, в частности, касающиеся развития эксплантов при длительном субкультивировании, почти не изучены. Однако это довольно важный вопрос, так как от способности микропобегов продолжительное время сохранять регенерационный потенциал зависит эффективность биотехнологий размножения in vitro. Влияние длительного субкультивирования на клональное размножение 25 Цель данного исследования - изучение морфометрических показателей развития эксплантов при длительном субкультивировании сортов и селекционных образцов M. officinalis и O. vulgare на втором этапе клонального микроразмножения. Материалы и методики исследования Исходным материалом для исследований служили экспланты трех сортов Melissa officinalis L. (Цитронелла, Соборная, Крымчанка) и перспективного селекционного образца № 10 Origanum vulgare L. Донорные растения выращивали в условиях закрытого грунта. Для соблюдения условий асептики все работы по введению в культуру и микрочеренкованию побегов in vitro выполняли в условиях бокса БАВнп-01-«Ламинар-С»-1,2 (Россия). Для стерилизации растительный материал предварительно промывали в мыльном растворе (15-20 мин) и ополаскивали в проточной и дистиллированной воде. Дальнейшую стерилизацию осуществляли в условиях ламинарного бокса. В качестве стерилизующих веществ для освобождения от экзогенной инфекции применяли 70%-ный этанол - 1 мин, и 50%-ный раствор препарата «Брадофен» 10 Н («ФЛОРИН АО», Венгрия) - 4 мин. Эксперименты проводили согласно общепринятым в биотехнологии растений методам культивирования тканей и органов in vitro [8, 9]. Для введения в культуру in vitro использовали пазушные меристемы с двумя листовыми примордиями (размером 0,4-1,0 мм, в зависимости от вида растения). Меристемы вычленяли под стереоскопическим микроскопом МСП-1 (Россия) в асептических условиях ламинарного бокса. На втором этапе (собственно микроразмножения) в качестве эксплантов использовали сегменты стебля с одним узлом (5-8 мм), полученные при микрочеренковании побегов, развившихся из почек при введении in vitro. При длительном пассировании после множественного побегообразования для дальнейшего субкультивирования отбирали хорошо развившиеся пазушные и адвентивные микропобеги, из которых выделяли микрочеренки 3-4-го ярусов. Экспланты помещали на поверхность агаризованной питательной среды Мурасиге и Скуга (МС) [26] с добавлением 6-бензиламинопурина (БАП) и гибберелловой кислоты (ГК3) («Sigma», США). Для введения в культуру in vitro меристем у мелиссы использовали ранее оптимизированную питательную среду МС, дополненную 1,0 мг/л БАП и 0,5 мг/л ГК3 [27], а у душицы -МС с 1,0 мг/л БАП [28]. При последующих субкультивированиях микрочеренки помещали на питательную среду МС с 0,5 мг/л БАП [27]. Культивирование проводили в колбах (душица) или стеклянных банках (мелисса) объемом 200 мл с 35 мл питательной среды. В каждый культуральный сосуд помещали по 3-4 экспланта. Анализ морфометрических показателей проводили на 30-35-е сутки культивирования. При этом определяли частоту множественного побегообразования (%), количество побегов 26 Н.А. Егорова, О.В. Якимова (шт./эксплант), длину побега (мм), количество узлов (шт./побег), частоту ризогенеза (%) и оводненных побегов (%). Частоту множественного побегообразования, ризогенеза и оводненных побегов (%) рассчитывали как отношение числа эксплантов соответственно - с несколькими побегами, корнями или витрифицированными побегами к общему числу анализируемых эксплантов, умноженное на 100. Коэффициент размножения рассчитывали как число микрочеренков, которое можно получить после одного субкультивирования. Для этого количество образующихся из одного экспланта побегов умножали на число узлов на побеге. При таком расчете не учитывали оводненные микропобеги. После анализа морфометрических параметров в асептических условиях побеги разрезали на микрочеренки с одним узлом и переносили в культуральные сосуды со свежей питательной средой. Изолированные меристемы и побеги культивировали при 26±2°С, относительной влажности воздуха 70%, освещенности 2-3 клк с 16-часовым фотопериодом. Опыты проведены в 3-кратной повторности (одновременно), при этом в каждом варианте анализировали не менее 20 эксплантов. Статистическая обработка данных проведена согласно общепринятым методам математической статистики при помощи стандартного пакета документов Microsoft Office Excel (2010). Статистическую значимость различий оценивали по ^-критерию Стьюдента при p

Ключевые слова

мелисса, душица, эксплант, размножение in vitro, множественное побегообразование, субкультивирование, коэффициент размножения, lemon balm, oregano, explants, propagation in vitro, multiple shoot formation, subculture, multiplication index

Авторы

ФИООрганизацияДополнительноE-mail
Егорова Наталья АлексеевнаНаучно-исследовательский институт сельского хозяйства Крымад-р биол. наук, доцент, зав. лабораторией биотехнологии отдела эфиромасличных и лекарственных культурyegorova.na@mail.ru
Якимова Ольга ВалерьевнаНаучно-исследовательский институт сельского хозяйства Крыман. с. лаборатории биотехнологии отдела эфиромасличных и лекарственных культурolyyakimova@yandex.ru
Всего: 2

Ссылки

Паштецкий В.С., Невкрытая Н.В., Мишнев А.В., Назаренко Л.Г. Эфиромасличная отрасль Крыма. Вчера, сегодня, завтра. Симферополь : ИТ «Ариал», 2018. 320 с
Атлас лекарственных растений России / под ред. А.В. Быкова. М. : Щербинская типография, 2006. 345 с
Moradkhani H., Sargsyan E., Bibak H., Naseri B., Sadat-Hosseini M., Fayazi-Barjin A., Meftahizade H. Melissa officinalis L., a valuable medicine plant: A review // Journal of Medicinal Plants Research. 2010. Vol. 4, № 25. PP. 2753-2759
Garcia-Beltran J.M., Esteban M.A. Properties and application of plants of Origanum sp. genus // SM Journal of Biology. 2016. № 2 (1). 1006. PP. 1-10
Derwich E., Benziane Z., Manar A., Boukir A., Taouil R. Phytochemical analysis and in vitro antibacterial activity of the essential oil of Origanum vulgare from Morocco // American-Eurasian Journal of Scientific Research. 2010. Vol. 5, № 2. PP. 120-129.
Chishti Sh., Kaloo Z.A., Sultan Ph. Medicinal importance of genus Origanum: A review // Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy. 2013. Vol. 5 (10). PP. 170-177. doi: 10.5897/ JPP2013.0285
Невкрытая Н.В., Аметова Э.Д., Марченко М.П. Итоги работы по созданию нового сорта Melissa officinalis L. // Ученые записки Таврического национального университета имени В.И. Вернадского. Серия: «Биология, химия». 2014. Т. 27 (66), № 5. С. 110-118.
Davey M.R., Anthony P. Plant cell culture: essential methods. Singapore : Markono Print Media Ptc. Ltd, 2010. 335 p.
Кушнір Г.П., Сарнацька В.В. Мікроклональне розмноження рослин. Teopia i практика. К. : Наукова думка, 2005. 270 с.
Основы создания генобанка in vitro видов, сортов и форм декоративных, ароматических и плодовых культур / под ред. И.В. Митрофановой. Симферополь : АРИАЛ, 2018. 260 с.
Ghiorghita G.I., Maftei D.E.St., Nicuta D.N. Investigations on the in vitro morphogenetic reaction of Melissa officinalis L. species // Analele Stiintifice ale Universitatii “Alexandru Ioan Cuza'', Genetica si Biologie Moleculara. 2005. Vol. 5. PP. 119-126.
Meftahizade H., Lofti M., Moradkhani H. Optimization of micropropagation and establishment of cell suspension culture in Melissa officinalis L. // African Journal of Biotechnology. 2010. Vol. 9, № 28. PP. 4314-4321. doi: 10.5897//AJB10.208
Mohebalipour N., Aharizad S., Mohammadi S.A., Motalibiazar A.R., Arefi H.M. Effect of plant growth regulators BAP and IAA on micropropagation of Iranian lemon balm (Melissa officinalis L.) landraces // Journal of Food, Agriculture & Environment. 2012. Vol. 10 (1). PP. 280-286.
Goleniowski M.E., Flamarique C., Bima P. Micropropagation of Oregano (Origanum vulgare x applii) from meristem tips // In vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 2003. Vol. 39. PP. 125-128. doi: 10.1079/IVP2002361
Bracamonte M.A., Bima P., Bongiovanni G., Golenowski M. Nutrition and micropropagation of Origanum vulgare x applii // Molecular Medicinal Chemistry. 2006. Vol. 11. PP. 6-7.
Nanova Zh., Slavova Y. Mass vegetative propagation of winter marjoram (Origanum vulgare ssp. Hirtum (Link) jetswaart) // Bulgarian Journal of Agricultural Science, National Centre for Agrarian Sciences. 2006. Vol. 12. PP. 531-536.
Oluk E.A., Cakir A. Micropropagation of Origanum sipyleum L., an endemic medicinal herb of Turkey // African Journal of Biotechnology. 2009. Vol. 8 (21). PP. 5769-5772.
Ozkum D. In vitro shoot regeneration of oregano (Origanum minutiflorum O. Schwarz & Davis) // Hacettepe Journal of Biology and Chemistry. 2007. Vol. 35 (2). PP. 97-100.
Shakeri S.M., Kazemitabar S.K., Sinaki J.M. In vitro culture of Melissa officinalis without the use of hormones // International Journal of Agriculture and Crop Sciences. 2013. Vol. 6 (20). PP. 1382-1387.
Meftahizade H., Moradkhani H., Naseri B., Lofti M, Naseri A. Improved in vitro culture and micropropagation of different Melissa officinalis L. genotypes // Journal of Medicinal Plants Research. 2010. Vol. 4, № 3. PP. 240-246.
Oana C.T., Falticeanu M., Prisecaru M. Considerations regarding the effects of growth regulators over the in vitro morphogenetic reaction at Origanum vulgare L. // Journal Plant Development. 2008. Vol. 15. PP. 133-138.
El Beyrouthy M., Elian G., Abou Jaoudeh C., Chalak L. In vitro propagation of Origanum syriacum and Origanum ehrenbergii // Acta Horticultural. 2015. № 1083. PP. 169-172. doi: 10.17660/ActaHortic.2015.1083.19
Fokina A.V., Satarova T.M., Smetanin V.T., Kucenko N.I. Optimization of microclonal propagation in vitro of oregano (Origanum vulgare) // Biosystems Diversity/ 2018. Vol. 26, № 2. PP. 98-102. doi: 10.15421/011815
Sevindik B., izgu T., Simsek O., Tutuncu M., Curuk P., Yilmaz O., Kaynak G., Kacar Y.A., Silva J.A.T., Mendi Y.Y. In vitro culture of turkish Origanum sipyleum L. // American Journal of Plant Biology. Special Issue: Plant Molecular Biology and Biotechnology. 2017. Vol. 2, № 5-1. PP. 32-36. doi: 10.11648/j.ajpb.s.2017020501.16
Korkor A.M., Mohamed S.A., Abd Elkafie O.M., Gohar A.A. Adaptation of the in vitro culture of Origanum majorana L. for production of phenolic acids // IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 2017. Vol. 12, № 2. PP. 30-38. doi: 10.9790/30081202013038
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiologia Plantarum. 1962. Vol. 15, № 3. PP. 473-479.
Якимова О.В., Егорова Н.А. Влияние состава питательной среды, типа экспланта и генотипа на клональное микроразмножение Melissa officinalis L. // Ученые записки Крымского федерального университета имени В.И. Вернадского. Биология. Химия. 2018. Т. 4 (70), № 1. С. 158-167.
Якимова О.В., Егорова Н.А. Влияние состава питательной среды и генотипа на клональное микроразмножение душицы in vitro // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2015. Вып. 4 (55). С. 304-309.
Liu M., Jiang F., Kong X., Tian J., Wu Z., Wu Zh. Effects of multiple factors on hyperhydricity of Allium sativum L. // Scientia Horticulturae. 2017. Vol. 217. PP. 285-296. doi: 10.1016/j. scienta.2017.02.010
Поливанова О.Б., Чередниченко М.Ю. Пути преодоления витрификации многоколосника фенхельного Agastache foeniculum (Pursh) Kuntze (Lamiaceae) в культуре in vitro // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2017. Вып. 5. С. 17-28. doi: 10.26897/0021-342X-2017-5-17-28
Yegorova N.A., Mitrofanova I.V., Brailko V.A., Grebennikova O.A., Paliy A.E., Stavtseva I.V. Morphogenetic, physiological, and biochemical features of Lavandula angustifolia at long-term micropropagation in vitro // Russian Journal of Plant Physiology. 2019. Vol. 66, № 2. РР. 326-334. https://link.springer.com/article/10.1134/S1021443719010060
Егорова Н.А., Ставцева И.В., Митрофанова И.В. Влияние сорта и факторов культивирования in vitro на клональное микроразмножение розы эфиромасличной // Бюллетень государственного Никитского ботанического сада. 2016. № 120. С. 36-43.
Zagorskaya М., Yegorova N. Effect of prolonged cultivation on the micropropagation in vitro of mint cultivars and breeding samples // BIO Web of Conferences. 2018. Vol. 11. Article Number 00049. doi: 10.1051/bioconf/20181100049
Егорова Н.А., Ставцева И.В., Якимова О.В., Каменек Л.И., Кривохатко А.Г. Некоторые аспекты клонального микроразмножения и сохранения in vitro эфиромасличных растений // Таврический вестник аграрной науки. 2015. № 1 (3). С. 18-24.
Влияние длительного субкультивирования на клональное микроразмножение <i>Melissa officinalis</i> L. и <i>Origanum vulgare</i> L. | Вестник Томского государственного университета. Биология. 2019. № 47. DOI: 10.17223/19988591/47/2

Влияние длительного субкультивирования на клональное микроразмножение Melissa officinalis L. и Origanum vulgare L. | Вестник Томского государственного университета. Биология. 2019. № 47. DOI: 10.17223/19988591/47/2