Fatty acid desaturase gene transcription at Solanum tuberosum L. cold adaptation.pdf Введение Проблема выживания растений в условиях действия низких температур становится все более актуальной в свете глобальных изменений кли- Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов 175 мата и возрастающей потребности населения в продовольствии. В связи с этим исследования воздействия гипотермии на растения имеют не только фундаментальный, но и прикладной характер [1, 2]. Картофель - важная продовольственная культура, занимающая четвертое место в мире по объемам производства после пшеницы, риса и кукурузы. Развитие его клубней зависит от температурных условий выращивания. Реальная урожайность картофеля существенно ниже его потенциальной продуктивности, причем одним из главных ограничивающих урожай факторов является недостаточная устойчивость многих современных сортов к весенним заморозкам [3]. В связи с этим поиски путей повышения урожайности картофеля тесно связаны с фундаментальными исследованиями процессов формирования устойчивости растений к гипотермии. В литературе широкое распространение получила теория, согласно которой при пониженных температурах происходит фазовый переход мембранных липидов, приводящий к снижению текучести мембран, инактивации мембранных ферментов, потере барьерных свойств мембранами и как результат, к гибели клеток [4]. Клетки растений способны поддерживать текучесть мембран за счет работы ферментов из группы дегидрогеназ - десатураз жирных кислот (ЖК), катализирующих превращение одинарной (С-С) связи между атомами углерода в ацильных цепях ЖК в двойную (С=С). В ходе этой реакции насыщенные ЖК превращаются в ненасыщенные, что приводит к изменению свойств мембранных липидов. Десатуразы работают строго последовательно, продукт каждой реакции служит субстратом для последующей [5, 6]. Для высших растений большая часть информации о функциях и специфичности десатураз ЖК получена при изучении мутантов Arabidopsis thaliana, отдельных по специфичной десатуразной активности [7]. Известно, что десатуразы арабидопсиса (FAD - fatty acid desaturase) подразделяются на несколько подсемейств. Стеароил-АПБ десатураза (FAB2 или SSI2) является растворимой десатуразой и катализирует десатурацию стеариновой кислоты (С18:0) до моноеновой олеиновой (C∣8.∣δ9) ЖК в связанной с ацилпереносящим белком (АПБ) форме. Кроме того, у арабидопсиса имеется А9-ацил-липидная десатураза (ADS), которая участвует в десатурации С16:0 в ЭПР. Микросомальная десатураза FAD2 и хлоропластная десатураза FAD6 представляют собой А12-ацил-липидные десатуразы, которые участвуют в образовании диеновой линолевой кислоты (C18:2Δ9,^^) в эндоплазматическом ретикулуме и пластидах соответственно. Микросомальная ω3(Δ15)-десатураза FAD3 и пластидные ω3(Δ15)-десатуразы FAD7, FAD8 участвуют в образовании линоленовой (С18:3Δ9,^^,^5) ЖК. Хлоропластн^іе транс Δ3-десатураза (FAD4 или FADA) и Δ7-десатураза (FAD5) специфически образуют C16:1 в ФГ и МГДГ соответственно. Кроме того, имеются специфичные Δ8- и Δ4-десатуразы сфинголипидов (SLD и DES) [8]. При этом основная роль в поддержании текучести мембран хлоропластов отводится ∆12- и ω3-ацил-липидным десатуразам, участвующим в образовании полинена- 176 Н.В. Нарайкина, В.Н. Попов, К.С. Миронов и др. сыщенных ЖК (ПНЖК) с двумя и тремя двойными связями соответственно [9,10]. Так, мутант A. thaliana по гену FAD6 с неактивной хлоропластной А12-дес-ат^'разой накапливал высокие концентрации пальмитолеиновой (C16.1) и олеиновой (С18:1) кислот. При этом уменьшалось содержание диеновых и трие-новых ЖК в галактолипидах хлоропластов и наблюдалось снижение устойчивости к низкой температуре [7, 11]. Среди всех мембран растительной клетки хлоропластные мембранні играют особую роль в формировании устойчивости растений к низким температурам, поскольку именно в хлоропластах происходит фотосинтез, продукты которого служат основным источником энергии, необходимой для перестройки клеточной структуры и метаболизма, происходящей в период низкотемпературного закаливания [12]. В тилакоидных мембранах растений картофеля локализован^! \\12-десат^'раза FAD6, а также единственная ω3-деса-тураза FAD7, хотя, согласно данным литературы, в хлоропластах многих других растений присутствуют две ω3-ацил-липидных десатуразы - FAD7 и FAD8, причем экспрессия последней индуцируется низкой температурой [7, 8, 13]. Кроме того, у картофеля имеются растворимые стеароил-АПБ десатуразы (SAD) в хлоропластах, участвующие в образовании первой двойной связи в положении \\9 у их субстрата - стеароил-АПБ. Именно данные гены выбраны нами для анализа изменений относительного содержания транскриптов в процессе закаливания растений картофеля к гипотермии. Цель работы - исследование роли ∆9-, ∆12- и ω3(\\l5)-ацил-липидных десатураз хлоропластной локализации, задействованных в биосинтезе основных моно-, ди-, и три-ненасыщенных жирных кислот, в преобразованиях жирнокислотного состава мембран хлоропластов в процессе формирования холодостойкости растений картофеля при низкотемпературном закаливании. Материалы и методики исследования Объект исследования - растения картофеля (Solanum tuberosum L., c. Юбилей Жукова), которые выращивали из клубней в течение 3 недель в торфогрунте (50% верхового торфа, 50% пойменной земли с добавлением перлита) при температуре 22°С, освещенности 100 мкмоль/(м2 с) и 16-часовом фотопериоде в камере фитотрона ИФР РАН (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева, РАН). Сорт Юбилей Жукова в Госреестре с 2000 г., выведен ВНИИКХ им. А.Г. Лорха, описан как экологически пластичный, устойчивый к вирусным болезням, альтериозу, среднеустойчивый к фитофто-розу, парше обыкновенной и ризоктониозу [14]. По отношению к пониженным температурам почвы описан как относительно устойчивый [14]. Закаливание растений проводили в климатической камере KBW-240 «Binder» (Германия) в условиях 16-часового фотопериода и освещенности 100 мкмоль/(м2 с) при температуре 3°С в течение 7 суток. В качестве контроля использовали растения, не подвергнутые действию закаливающей температуры. Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов 177 Для оценки эффективности закаливания целые растения картофеля промораживали при температуре -2°С в течение 18 часов в климатической камере MIR-153 «Sanyo» (Япония), затем их переносили в нормальные условия выращивания (22°С) и через двое суток визуально оценивали выживаемость. Для выделения РНК использовали листья 3-4-х ярусов, которые отделяли от растений контрольной группы (22°С) до начала закаливания, а также растений, находившихся в условиях закаливания при 3°С в течение двух часов, 1, 3, 5, и 7 суток. Тотальную РНК из листьев растений выделяли с помощью набора Spectrum Plant Total RNA Kit «Sigma» (США) согласно протоколу производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили, используя набор реагентов и протокол MMLV RT Kit «Евроген» (Россия). Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с помощью амплификатора CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System «Bio-Rad» (США), используя набор реагентов qPCRmix-HS SYBR kit «Евроген» (Россия). Расчет относительного содержания мРНК гена в пробе проводили с помощью вычисления величины нормализованной экспрессии (ΔΔCT). Эффективности ОТ-ПЦР, рассчитанные методом калибровочных кривых для всех пар праймеров, учитывали при проведении анализа [15]. Праймеры к исследуемым генам десатураз ЖК подобраны с использованием базы данных NCBI и интернет-ресурса Primer3Plus: SAD (LOC 102577562) -(F) CCAGTGAAGGACGCAGAGCAC, (R) GGGACTTCGTTGCTTGGCCC; FAD6 (LOC 102590621) - (F) GCACGAAGACACAGCTTGGC, (R) TGACAGAGCCACCAGTGAGC); FAD7 (LOC 102597672) - (F) TCTACCCTTTCCCTTGCTGGCA, (R) CATTGCCGTCCAGCAGACAGT; к референсным генам: фактор элонгации 1α eEF1a (LOC DQ252497) -(F) GGCCAACAGACAAACCCCTCC, (R) GCCTCGTGGTGCATCTCAACA; рибосомальный белок L2 (LOC 102577640) - (F) GGAGCCAAAAAGATTGTGCCC, (R) AGCAGTTCCTCTTCACACGG. В качестве контроля ответной реакции на действие холода использовалиген белкатеплового шока (БТШ) ΛCS7∙∕^Λ' (LOC 102594276) - (F) TCCAGCTTCATTCGTCAACTCAAC, (R) CTCCTCCAGCTGGGATGGTT. Интактные хлоропласты выделяли в буфере, содержащем 0,33 М сорбит, 50 мМ трицин рН 8.0, 2 мМ ЭДТА, 1 мМ MgCl2, 5 мМ меркаптоэтанол. Гомогенат фильтровали через 2 слоя Miracloth (США), центрифугировали при 2000 g, используя центрифугу K23D (Германия). Осадок ресуспендиро-вали в буфере, наслаивали на ступенчатый градиент перкола (40/80%). Интактные хлоропласты отбирали на границе 40 и 80% перкола. [16]. Липиды хлоропластов подвергали метилированию посредством кипячения в смеси CH3OH и CH3COCl в течение 1 ч, как описано ранее [17]. В качестве внутреннего стандарта использовали маргариновую кислоту. Полученные метиловые эфиры ЖК очищали с помощью ТСХ на пластинке с силикагелем, в качестве растворителя применяя смесь гексан : эфир : уксусная кислота в соотношении 90:10:1, экстрагировали бензолом и анализировали методом ГЖХ-МС на приборе Agilent 7890A GC (США) [18]. Для оценки уровня не- 178 Н.В. Нарайкина, В.Н. Попов, К.С. Миронов и др. насыщенности ЖК в липидах мембран хлоропластов табака рассчитывали индекс ненасыщенности (ИН): ИН = ΣPiei∕100, где Pi - содержание i-той ЖК (%), ei - число двойных связей в i-той ЖК [17]. Все эксперименты проведены в 5-6 биологических повторностях и 3-4 аналитических. Статистическая обработка данных проведена в программе SigmaPlot 11. Данные представлены в виде средних значений и их стандартных ошибок. Результаты исследования и обсуждение Известно, что устойчивость растений к действию холода формируется в процессе закаливания при низких (но не повреждающих) температурах [2] и обусловливается структурно-функциональной перестройкой клеток, связанной с изменениями на молекулярном уровне, в зависимости от генотипа растений. Поэтому на первом этапе работы необходимо было убедиться, что закаливание растений картофеля при 3°С в течение 7 суток приводило к повышению их устойчивости к действию повреждающих температур. Поскольку низкие положительные температуры не вызывают у холодостойких растений визуальных повреждений, мы применили метод прямого промораживания растений с последующим определением их выживаемости. Показано, что после действия температуры -3°С в течение 18 ч растения обоих вариантов погибали, в связи с чем использовали температурную экспозицию -2°С в течение 18 ч. При этом режиме закаленные растения картофеля выживали, а незакаленные - погибали, что свидетельствует о достаточно высокой эффективности закаливания Solanum tuberosum L., сорта Юбилей Жукова (рис. 1). Рис. 1. Контрольные (1) и закаленные (2) растения картофеля через сутки после промораживания при температуре -2°С (a) и -3°С (b) в течение 18 ч. Автор фото Н.В. Нарайкина [Fig. 1. Control (1) and cold-adapted (2) potato plants (one day after freezing at -2°C (a) and -3°C (b) for 18 hours). Photo by NV Naraikina] Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов 179 Изменения относительного содержания транскриптов генов растворимой стеароил-АПБ десатуразы, ∆12- и ω3(\\∣5)-ацил-липидиых десатураз хлоропластов представлены на рис. 2. За единицу принято нормализованное содержание транскриптов исследуемых генов у незакаленных растений. Показано, что относительное содержание транскриптов гена FAD7 оставалось стабильным и поддерживалось на уровне контроля. Для гена FAD6 наблюдали кратковременное повышение содержания транскриптов в первые два часа закаливания, что соответствует данным литературы [19]. К пятым суткам закаливания у генов FAD6 и FAD7 наблюдали статистически значимое снижение относительного содержания транскриптов. Характер экспрессии гена SAD, кодирующего ∆9 стеароил-АПБ десатуразу ЖК, резко отличался от остальных: относительное содержание его транскриптов снижалось в ходе закаливания в разной степени. Выбранный нами для исследования ген стеароил-АПБ десатуразы имеет высокую гомологию с геном SSI2 арабидопсиса. Из данных литературы известно, что мутант арабидопсиса с «выключеным» геном ssi2/fab2 имеет высокое содержание стеариновой (С18:0) ЖК и низкое содержание олеиновой (С18:1) ЖК. Несмотря на то, что в дополнение к SSI2 в геноме A. thaliana присутствуют гены еще шести подобных ферментов, их экспрессия не способна компенсировать мутацию в ssi2 [20]. То есть этот ген является ключевым в семействе генов стеароил-АПБ. Согласно данным литературы, этот фермент настолько активен, что практически весь новообразованный стеароил-АПБ быстро превращается в олеоил-АПБ [5, 13, 21]. Поэтому мы связываем снижение относительного содержания мРНК данного гена с некоторым угнетением биосинтеза С18 жирных кислот в условиях холодового стресса. Следует отметить, что в геноме картофеля обнаружено 13 генов, кодирующих растворимые ацил-АПБ десатуразы, образующие первую двойную связь, белки которых локализуются в строме хлоропластов, в связи с чем требуется дальнейшее изучение этой группы генов. Данные по составу и содержанию ЖК липидов хлоропластов картофеля представлены в таблице. В липидах хлоропластов, выделенных из листьев контрольных растений как до, так и после закаливания, идентифицированы восемь различных остатков С16- и С18-ЖК, основными представителями которых являлись пальмитиновая (C16.0), гексадекатриеновая (C16, 3δ7'10'13), линолевая (C18.2δ9,12) и а-линоленовая (C18.3δ9,12,15) ЖК, причем на долю а-линоленовой кислоты приходилось почти 60% от суммы ЖК хлоропластов. Следует отметить, что картофель, как и A. Ihaliana, относится к группе «16:3» растений, у которых в отличие от «18:3» растений в хлоропластах содержится значительное количество C16:3 ЖК [10]. За время низкотемпературного закаливания (3°C, 7 сут) состав ЖК мало изменялся. Анализ содержания ПНЖК показал, что в процессе закаливания происходило увеличение содержания пальмитиновой (C16:0) кислоты, что может свидетельствовать о повышении интенсивности синтеза ЖК de novo. 180 Н.В. Нарайкина, В.Н. Попов, К.С. Миронов и др. HSF A8 SAD FAD6 FAD7 Рис. 2. Изменение относительного содержания транскриптов генов десатураз жирных кислот хлоропластов растений картофеля в динамике низкотемпературного закаливания (3°C, 1 сут). SAD - растворимая ∆9-AΠ^ десатураза, FAD6 - ∆12-ацил-липидная десатарураза, FAD7 - ω3(∆15)-ацил-липидная десатураза и HSFA8 - БТШ А8 (контроль холодового воздействия). На оси Y «Относительные единицы транскрипции, RQ», на оси X «продолжительность закаливания, сут». RQ определено методом ΔΔCT. Данные прелставлены в виде средних значений и их стандартных ошибок с использованием /-критерия Стьюдента. * - Статистически значимое отличие от контроля (р < 0,05) [Fig. 2. Changes in the transcript content of potato plant chloroplast fatty acid desaturase genes in the dynamics of low-temperature adaptation (3°C, 7 days). SAD - soluble ∆9-ACP desaturase, на FAD6 - acyl-lipid ∆12-desaturase, FAD7 - acyl-lipid ω-3(∆15)-desaturase and HSFA8 - HSF A8 (control of cold exposure). On the Y-axis - Relative expression, RQ; on the X-axis -Time of adaptation, day.*RQ was determined by the method ΔΔCT. The data are expressed as the mean with standard error using Student's /-test (p < 0.05). *Statistically significant difference from control (p < 0.05)] Продолжительность закаливания, сут [Time of adaptation, day] Соединение С16:0-АПБ, являющееся предшественником С16:0 ЖК, используется в разных путях биосинтеза. Так, оно может в дальнейшем удлиняться до стеароил-АПБ с помощью фермента кетоацилсинтазы II (КАС II) или С16:0 ЖК может отделиться от АПБ с помощью ацил-АПБ тиоэстеразы (фермент, принадлежащий к классу ацил-АПБ-гидролаз) и подвергаться дальнейшей десатурации в липидсвязанной форме или транспортироваться из пластид в ЭПР. Таким образом, снижение активности фермента КАС II (одного из ферментов многокомпонентной синтазы ЖК), который удлиняет С16:0-АПБ до С18:0-АПБ, может приводить к повышению содержания пальмитиновой Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов 181 кислоты. С другой стороны, повышение активности ацил-АПБ тиоэстеразы также может приводить к повышению содержания пальмитиновой ЖК. Так, в литературе имеются данные о повышении содержания транскриптов гена пальмитоил-АПБ тиоэстеразы почти в четыре раза после кратковременного действия закаливающей температуры на растения картофеля [19]. Кроме того, в настоящей работе наблюдали повышение содержания С∣6:∣∆7 ЖК, как известно, играющей положительную роль в поддержании текучести мембран, поскольку при низкой температуре необходимо не только повышение количества ЖК с большим числом двойных связей, но и увеличение содержания ЖК с меньшим числом углеродных атомов. Это может свидетельствовать о повышении активности А7-десат^'разы FAD5, которая специфически образуют C16:1 ЖК в ФГ и МГДГ хлоропластов соответственно. Согласно нашим данным, представленным в таблице, содержание а-линоленовой ЖК - главной ПНЖК хлоропластов, к седьмым суткам закаливания поддерживалось на высоком конститутивном уровне и составляло 50% от суммы ЖК. Представляет интерес сравнить эти показатели с данными литературы, согласно которым у картофеля сорта Невский происходило повышение содержания а-линоленовой кислоты после низкотемпературного закаливания с 38 до 43% [22], но эти показатели оставались даже ниже, чем у изученного нами сорта. Широко известно, что а-линоленовая кислота (и ее структурный аналог - гексадекатриеновая кислота) имеет уникальное значение в жизни растений [23] благодаря системе двойных связей. Она способна принимать спиральную конформацию и образовывать комплексы с мембранными липидами. Такие комплексы галактолипидов с белками обеспечивают построение фотосинтетических субъединиц хлоропласта, оптимальную пространственную ориентацию гидрофильных структур хлорофилла и возможность беспрепятственного переноса электронов в безводной среде. Следует отметить, что незначительное снижение содержания ПНЖК может быть связано как со снижением относительного содержания транскриптов гена SAD (рис. 2), кодирующего ∆9 стеароил-АПБ десатуразу ЖК, участвующую в образовании олеиновой кислоты, так и с интенсификацией пероксидного окисления липидов при резком снижении температуры в начале закаливания. Так, ранее нами показано возрастание его интенсивности у картофеля к третьим суткам низкотемпературного закаливания с последующим снижением до уровня вегетирующих растений к шестым суткам закаливания [24]. Таким образом, среди изученных генов ∆9-, Δ12-, ω3-gесатураз хлоропластов обнаружено кратковременное (через 2 ч закаливания) увеличение содержания транскриптов только гена FAD6, кодирующего Δ12-ацил-липидную десатуразу хлоропластов. Относительная транскрипция гена FAD7, кодирующего единственную ω3-gесатуразу хлоропластов, оставалась на неизменном уровне, что, вероятно, способствовало поддержанию высокого конститутивного уровня триеновых ЖК. 182 Н.В. Нарайкина, В.Н. Попов, К.С. Миронов и др. Изменение относительного содержания жирных кислот липидов хлоропластов в результате низкотемпературного закаливания (3°С, 7 сут) растений картофеля, мас % + m [Change in the relative content of fatty acids of chloroplast lipids after low-temperature adaptation (3°C, 7 days) of potato, mas% + m] Название ЖК [Name of FA] Состав ЖК [FA composition] мас [mas] % мас [mas] % 22°С (до закаливания) [before adaptation] 7 сут., 3°С (после закаливания) [7 days, 3°С after adaptation] C '"''16∙0 13,0±2,1 19,1±4,1* '^16∙1 0,0±0,0 3,1±2,0* P ∆9 '^16∙1 4,3±0,1 3,6±0,3* P ∆7,10 '-×16∙2 1,7±0,1 1,2±0,4 P ∆7.10.13 ^16∙3 12,6±0,2 12,1±0,4 C '-'18∙∩ 0,9±0,1 1,1±0,7 C ∆9 18∙1 1,2±0,1 1,2±0,1 C ∆9,12 '"''18∙2 9,0±0,3 8,4±0,2 P ∆9,12,15 18∙3 57,2±0,9 50,2±1,7* Сумма НЖК [Sum of SFA] 13,9±2,3 20,2±3,1* Сумма ПНЖК [Sum of PUFA] 86,1±0,8 79,8±1,5* Сумма ЖК [Sum of FA] 100 100 ИН [The Index of Unsaturation] 2,11 2,02 Примечание. Мас % - отражает содержание ЖК относительно суммы ЖК, ± m - стандартная ошибка, * - статистически значимое отличие от контроля (р < 0,05). [Note. Mas % - Reflects FA content relative to the total of FA, ± m - standard error of the mean, * statistically significant difference from control (p < 0.05)]. Суммарная доля ПНЖК липидов хлоропластов картофеля в незакаленных растениях составляла почти 90% от общего содержания всех ЖК и за время низкотемпературного закаливания сохранялась на высоком уровне. Высокое содержание ПНЖК способствует поддержанию тилакоидных мембран хлоропластов в функциональном состоянии, что в свою очередь позволяет растениям картофеля реализовать прохождение других процессов, способствующих закаливанию растений к низким температурам [25]. Заключение На основании полученных данных можно предположить, что закаливание изученного сорта картофеля в целом направлено на поддержание конститутивно высокого содержания ПНЖК хлоропластов в процессе закаливания и увеличение синтеза ЖК de novo. Повышение содержания транскриптов гена FAD6 в начале этого периода, по-видимому, способствовало сохранению и поддержанию в активном состоянии пула Δ12-десатураз, осуществляющих синтез линолевой кислоты, благодаря чему растения были обеспечены достаточным количеством этих жизненно важных ЖК. Стабильно высокое содержание ПНЖК, входящих в состав мембранных липидов хлоропластов, Транскрипция генов десатураз жирных кислот хлоропластов 183 на протяжении всего периода закаливания способствует поддержанию тилакоидных мембран хлоропластов в функциональном состоянии, что позволяет растениям картофеля успешно закаливаться к гипотермии.

Скачать электронную версию публикации