Effect of warm acclimation rate on fatty acid composition and phase transitions of Saccharina japonica (J.E. Ares.pdf Сокращения: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГЖХ - газожидкостная хроматография; ДГДГ - дигалактозилдиацилглицерол; ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия; ЖК - жирные кислоты; ИН - индекс ненасыщенности; МГДГ - моногалактозилдиацил-глицерол; МНЖК - мононенасыщенные ЖК; МЭЖК - метиловые эфиры ЖК; НЖК - насыщенные ЖК; ПНЖК - полиненасыщенные ЖК; СХДГ - сульфохиновозилдиацилглицерол; Tmax - температура максимума теплопоглощения фазовых переходов липидов; ТСХ - тонкослойная хроматография. Введение Бурая водоросль сахарина японская (Saccharina japonica = Laminaria japonica) - ценный промысловый и наиболее широко культивируемый вид морских водорослей [1], рост и развитие которых в первую очередь определяется температурным фактором среды обитания [2]. Поэтому исследования молекулярных механизмов термоадаптации сахарины японской актуальны, так как имеют не только важное теоретическое значение для понимания потенциальной способности водоросли к выживанию в условиях глобального потепления климата [3] и динамики функционирования морских экосистем в целом [4], но и большое практическое значение для рационального разведения марикультуры. Известно, что в последние десятилетия средние температуры воды в Мировом океане повышаются [3]. Для роста S. japonica наиболее благоприятны температуры от 8 до 15°С, тогда как температуры выше 18°С летом и ниже 4°С зимой предельны для развития жизненно важных процессов. Так, при температурах выше 18°С начинают разрушаться слоевища [5]. Замечено, что повышение средних температур морской воды в южном ареале обитания S. japonica - бухте Мацусима (северная Япония) с 24,5°С летом 2005 г. до 25,1°С в 2007 г. вызывало резкое снижение биомассы, более позднее появление спорофитов, ранний рост и разрушение талломов данной водоросли, что привело к смене места обитания данной популяции [6]. Последние прогнозы свидетельствуют о том, что тепловые волны в будущем будут более экстремальными и частыми [3, 7]. Следовательно, в условиях усиления вариабельности температуры окружающей среды особо важное значение приобретает скорость адаптационных изменений [8]. Однако до настоящего времени эффект скорости температурной акклимации на эктотермные организмы мало изучен. В современной литературе имеется информация о биологических особенностях морских макроводорослей, оптимальной температуре для вегетации и спороношения отдельных видов. Однако накопление знаний о морских макроводорослях происходит значительно медленнее по сравнению с темпами исследований микроводорослей, что отчасти связано с медленным ростом макроводорослей. В результате наблюдается значительное отставание в решении этой актуальной социально и экономически важной научной проблемы [9]. Особенно слабое внимание уделяется физико-химическим изменениям мембранных липидов, лежащих в основе температурной адаптации данной группы эктотермных организмов. Ключевым молекулярным механизмом термоадаптации эктотермных организмов, в том числе всех групп растений, является перераспределение в Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 137 составе жирных кислот (ЖК) мембранных липидов. Эти компенсаторные изменения направлены на поддержание оптимального для функционирования жидкокристаллического состояния липидного матрикса мембран. Поэтому феномен получил название гомеовязкостной адаптации [10]. В фотосинтезирующих клетках растений среди мембранных липидов преобладают гликолипиды, которые обеспечивают оптимальное функционирование фотосистем, влияя на конформацию белков фотосинтетических белковых комплексов и, таким образом, участвуя в регуляции работы фотосинтетического аппарата. Так, мутант десатуразы омега-6 жирных кислот в Arabidopsis thaliana может снижать уровни полиненасыщенных жирных кислот в галактолипидах хлоропластов и замедлять скорость восстановления комплекса фотосистемы II (ФС II) при низкой температуре [11]. Накапливается информация об участии липидов в механизмах защиты фотосинтетического аппарата при стрессах. Однако их роль на настоящее время остаётся слабоизученной [12-13]. Предыдущие исследования состава ЖК и термотропного поведения основных полярных липидов морских макрофитов (макроводорослей и трав) Японского моря показали, что при акклиматизации от зимы к лету наблюдается повышение насыщенности ЖК во всех полярных липидах, однако температуры максимумов теплопоглощения (Tmax) тепловых переходов гликолипидов моногалактозилдиацилглицерола (МГДГ), дигалактозилди-ацилглицерола (ДГДГ) и сульфохиновозилдиацилглицерола (СХДГ), образующих липидный матрикс тилакоидных мембран хлоропластов, не повышались, в отличие от Tmax полярных липидов экстрапластидных мембран (фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина и 1,2-диацилглицеро-Л',Л',Л'-триметилгомосерина) [14]. Такое неадекватное с точки зрения классического представления о гомеовязкостной адаптации поведение, возможно, связано с ролью гликолипидов в регуляции работы фотосистем [12]. Однако необходимо дальнейшее изучение физико-химических изменений основных полярных липидов фотосинтетических мембран в зависимости от скорости повышения температуры окружающей среды морских макрофитов для более ясного представления об их адаптационных возможностях в условиях глобального потепления климата. В связи с этим цель работы - исследование адаптационных изменений в гликоглицеролипидах как главных мембранных липидах морской макроводоросли S. japonica при различных скоростях тепловой акклимации от зимней температуры (4°С) к летней (20°С). Материалы и методики исследования Сбор растительного материала и постановка эксперимента. Талломы сахарины японской S. japonica (J.E. Areschoug) (Phaeophyceae) собраны в заливе Петра Великого Японского моря в феврале при температуре воды 138 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. 4°C на глубине 1,5-3 м (43° с. ш., 131° в. д.). Собранные водоросли (по 500 г сырой массы) прогревали в автоматическом режиме до 20°C со скоростью 16°С/сут (быстрая акклимация) и 2°С/сут (медленная акклимация) в термо-статируемых аквариумах с морской водой (объем - 100 л). Освещенность -40 мкЕ/(м2 с) при фотопериоде 12 ч свет : 12 ч темнота. Также для выделения липидов использовали талломы водорослей, собранные в феврале и августе при температуре воды 4 и 20°C соответственно. Водоросли тщательно очищали от эпифитов и мелких беспозвоночных и затем помещали в кипящую воду на 2 мин для инактивации липолитических ферментов. Эксперимент проведён в трёх повторностях. Экстракция и выделение липидов. Экстракт общих липидов получали по методу Блайя и Дайера [15]. Индивидуальные гликолипиды выделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле при последовательном элюировании системой растворителей хлороформ / ацетон (1:1, об/об), ацетоном и смесью ацетон / бензол / уксусная кислота / вода (200:30:3:10, об/об) [14]. Дополнительную очистку гликолипидов проводили с помощью препаративной одномерной ТСХ на силикагеле последовательно в системах хлороформ / ацетон (1:1, об/об) и ацетон / бензол / вода (91:30:6, об/об). Чистоту липидов проверяли с помощью двумерной ТСХ на силикагеле [16]. Процедуру выделения индивидуальных липидов повторяли трижды. Анализ ЖК состава. Анализ состава ЖК хроматографически чистых липидных препаратов проводили с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ), как описано ранее [14]. Этерификацию липидов выполняли с помощью системы ацетилхлорид / метанол (1:10, об/об) при 95°С в течение 1 ч. Метиловые эфиры ЖК (МЭЖК) экстрагировали н-гексаном и дочищали на ТСХ. Анализ МЭЖК проводили на газо-жидкостном хроматографе Agilent 6890 («Agilent», США) с пламенно-ионизационным детектором, в капиллярной колонке HP Innowax (30 м × 0,25 мм). В качестве газа-носителя использовали гелий (He). Колонку термостатировали при 200°С. Идентификацию МЭЖК проводили по времени удерживания на основании расчёта эквивалентной длины цепи [17] и путём сравнения с известными стандартами. Процентное содержание каждой ЖК рассчитывали по методу Кэррола [18]. Индекс ненасыщенности (ИН) рассчитывали по формуле: ИН = ΣP.e, где Р- содержание .-й ЖК (%), e. - число двойных связей в .-й ЖК. Анализ состава молекулярных видов гликолипидов. Аналитическое разделение молекулярных видов индивидуальных липидов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе Shimadzu-LC20 («Shimadzu», Япония) с масс-спектрометрическим детектором LCMS-2010EV и электроспрей-ионизацией. Колонку Ascentis C18 (25 см × 2,1 мм, размер частиц силикагеля 5 μm) («Supelco», США), термостатировали при 45°С [19]. Разделение проводили в непрерывном потоке растворителей (5 мМ водный раствор ацетата аммония / метанол / изопропанол) при скорости потока 0,3 мл/мин со следующими интервалами Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 139 постоянного состава элюента: 0 мин - 6:92:2, 30 мин - 6:79:15, 35-38 мин -6:69:25, об/об для МГДГ, ДГДГ и СХДГ. Детекцию МГДГ, ДГДГ проводили в режиме положительных ионов, а СХДГ - в режиме отрицательных ионов. Содержание аналитов рассчитывали по площади хроматографических пиков их квазимолекулярных ионов. Калориметрия. Термотропное поведение хроматографически чистых липидов исследовали методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) [14]. Образцы липидов, растворённые в хлороформе, помещали в стандартные алюминиевые контейнеры, высушивали под вакуумом до постоянной массы (около 10 мг), запаковывали и помещали в измерительную ячейку дифференциального сканирующего калориметра ДСМ-2М (Россия). Образцы нагревали со скоростью 16 °С/мин в интервале от -135 до 80°С при чувствительности 5 мВ. За температуру теплового перехода липида принимали температуру, при которой наблюдалось максимальное теплопо-глощение (Tmax). Диапазон температур калибровали по реперным образцам нафталина, ртути и индия. Статистический анализ. Данные представлены в виде средних арифметических значений с доверительным интервалом, n=9. Статистическую значимость отличий анализировали с использованием ^-критерия Стьюдента (p ≤ 0,05). Результаты исследования и обсуждение Мембранные липиды обеспечивают первичный контакт растительных клеток с окружающей средой, являются биосенсорами адаптационных процессов при изменении температурных условий и обеспечивают оптимальное для жизни жидкокристаллическое состояние биологических мембран [10]. Таким образом, изменение температуры морской воды для S. japonica в первую очередь вызовет адаптационный эффект в главных мембранных липидах, таковыми являются фотосинтетические гликолипиды. Для сравнения адаптационных изменений в липидном матриксе фотосинтетических мембран сахарины японской при быстрой (16°С/сут) и медленной (2°С/сут) тепловой акклимации выделяли гликолипиды МГДГ, ДГДГ и СХДГ из водоросли, собранной при 4°С зимой и акклимированной к летней температуре (20°С). В тилакоидных мембранах растений они составляют около 50, 25 и 12% соответственно [12]. Результаты анализа ЖК состава гликолипидов представлены в табл. 1-3. Для оценки эффективности перераспределения ЖК остатков при тепловой акклимации исследовали калориметрические переходы кристалл - жидкий кристалл гликолипидов (рис. 1). Для более детальной интерпретации тепловых переходов также провели анализ состава молекулярных видов гликолипидов (табл. 4-6). Для сравнительной оценки эффективности адаптационных перестроек в липидах S. japonica в зависимости от скорости тепловой акклимации исследован 140 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. ЖК состав и термотропное поведение гликолипидов S. japonica, собранной в летний и зимний периоды (см. табл. 1-4, рис. 1). Таблица 1 [Table 1] ЖК состав МГДГ Saccharina japonica в зависимости от скорости акклимации (% от суммы ЖК) [FA composition of MGDG of Saccharina japonica depending on the rate of thermal acclimation (% of total FAs)] ЖК [FAs] Зима [Winter] Быстрая аккли-мация [Rapid acclimation], 16°C/ day Медленная акклимация [Slow acclimation], 2°C/day Лето [Summer] 14:0 6,8 ± 0,3а 4,8 ± 0,2b 3,1 ± 0,1c 5,0 ± 0,2b 16:0 4,9 ± 0,2а 3,9 ± 0,2b 3,0 ± 0,2c 5,5 ± 0,1d 16:1 n-7 0,5 ± 0,2а 0,5 ± 0,3а 0,6 ± 0,1а 4,0 ± 0,3b 18:1 n-9 4,3 ± 0,5а 4,5 ± 0,1а 4,1 ± 0,3а 9,7 ± 0,2b 18:2 n-6 4,6 ± 0,1а 4,1 ± 0,4а 3,1 ± 0,4b 11,2 ± 0,5c 18:3 n-6 1,0 ± 0,3а 1,2 ± 0,2а 1,2 ± 0,1а 8,1 ± 0,1b 18:3 n-3 6,4 ± 0,1а 4,6 ±0,3b 3,8 ± 0,2c 8,8 ± 0,5d 18:4 n-3 63,5 ± 0:1а 60,9 ± 0,3b 60,2 ± 0,4b 20,4 ± 0,3c 20:4 n-6 0,4 ± 0,2а 1,0 ± 0,1b 1,7 ± 0,2c 10,0 ± 0,2d 20:5 n-3 6,1 ± 0,3а 13,1 ± 0,4b 18,3 ± 0,1c 16,0 ± 0,2d НЖК [SFA] 12,0 ± 0,2а 9,0 ± 0,2b 6,4 ± 0,2c 11,1 ± 0,1d МНЖК [MUFA] 4,7 ± 0,3а 5,1 ± 0,2а 4,6 ± 0,3а 13,7 ± 0,3b ПНЖК [PUFA] 83,3 ± 0,3а 85,9 ± 0,3b 89,0 ± 0,2c 75,2 ± 0,2d n-3 ПНЖК [n-3 PUFA] 7671 ± 0,4а 79,1 ± 0,2b 82,2 ± 0,2c 46,0 ± 0,3d n-6 ПНЖК [n-6 PUFA] 5,9 ± 0,2а 6,3 ± 0,3а 6,0 ± 0,2а 29,2 ± 0,2b n-3∕n-6 ПНЖК [n-3∕n-6 PUFA] 13,1 ± 0,3а 12,5 ± 0,2b 13,6 ± 0,2а 1,6 ± 0,3c ИН [UI] 324,1 ± 0,2а 345,4 ± 0,3b 364,3 ± 0,3c 287,4 ± 0,4d Ненасыщ. / насыщ. [UFA∕SFA] 7,3 ± 0,3а 10,2 ± 0,2b 14,7 ± 0,1c 8,0 ± 0,2d Примечание. Здесь и в табл. 2, 3 ЖК, процентное содержание которых во всех четырёх экспериментальных группах ниже 3%, в таблице не представлены, но учтены при расчетах общих параметров. НЖК, МНЖК, ПНЖК - суммы насыщенных, мононенасыщен-ных, полиненасыщенных ЖК соответственно; ИН - индекс ненасыщенности; ненасыщ. / насыщ. - соотношение между суммами ненасыщенных и насыщенных ЖК. Представлены средние значения ± доверительный интервал, n=9. Надстрочные латинские буквы обозначают статистическую значимость различий средних значений при р ≤ 0,05 по содержанию каждой ЖК. [Note. FAs with content lower than 3% in four experimental groups are excluded but considered in calculations of total parameters. SFA, MUFA and PUFA are sums of saturated, monounsaturated and polyunsaturated FAs, respectively; UI is unsaturation index; UFA/SFA is the ratio between the sums of unsaturated and saturated FAs. Mean values ± confidence interval, n = 9, are given. Superscript Latin letters denote the statistical significance of differences in mean values for p ≤ 0.05 in the content of each FA]. Результаты, полученные при исследовании гликолипидов S. japonica, собранной в летний и зимний периоды, согласуются с ранее опубликованными данными [14]. В настоящей работе мы использовали эти результаты для оценки эффективности акклимационных изменений. Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 141 ЖК состав гликолипидов S. japonica. Основной липид фотосинтетических (тилакоидных) мембран МГДГ является небислойным благодаря высокой ненасыщенности своего ЖК состава [20]. Так, содержание полине-насыщенных ЖК (ПНЖК) в данном липиде сахарины японской составляло 75-88% (см. табл. 1). Это способствует естественной деформации мембран и обеспечивает формирование кривизны тилакоидных мембран, необходимой для включения многочисленных мембранных белков [21]. Полинасы-щенные ЖК остатки, обладающие значительной структурной гибкостью, позволяют липидам приспосабливаться к различным формам белков в сосуществующих мембранных комплексах и стабилизировать их [10]. Показано, что и быстрая, и особенно медленная тепловая акклимация приводила к повышению ИН МГДГ S. japonica в отличие от эффекта смены сезона от зимы к лету [14] (см. табл. 1). При этом повышение ИН сопровождалось увеличением вклада ненасыщенных ЖК: соотношение ненасыщенные / насыщенные ЖК возрастало в 1,4 и 2 раза при быстрой и медленной акклимации соответственно, тогда как сезонная акклиматизация мало влияла на этот параметр. Наоборот, эффект тепловой акклимации как на соотношение n-3/n-6 ПНЖК, так и на большинство отдельных ЖК (16:1 n-7, 18:1 n-9, 18:2 n-6, 18:3 n-6, доминирующей 18:4 n-3 и 20:4 n-6) оказался незначительным в отличие от влияния смены сезона. Отмеченное ранее значительное снижение соотношения n-3/n-6 ПНЖК от зимы к лету, т.е. увеличение вклада n-6 ПНЖК в наиболее физиологически активный период [14], вероятно, связано с тем, что эти ПНЖК являются предшественниками более сильных медиаторов по сравнению с n-3 производными [22-23]. Уровень остальных ЖК снижался с уменьшением скорости тепловой акклимации, но при смене сезона мало изменялся за исключением 20:5 n-3, процентное содержание которой последовательно увеличивалось при понижении скорости тепловой акклимации и достигало уровня в летний период, т.е. акклима-ционные и акклиматизационные эффекты совпадали. Несмотря на то, что МГДГ является предшественником в биосинтезе ДГДГ [24], суммарные параметры (ИН, ненасыщенные / насыщенные ЖК и n-3/n-6 ПНЖК) ЖК состава ДГДГ, в отличие от МГДГ, изменялись при тепловой акклимации зигзагообразно: значительно снижались при быстрой акклимации, что совпадало с направлением изменений при смене сезона от зимы к лету, а затем возрастали и даже превосходили исходный уровень (ИН, ненасыщенные / насыщенные ЖК) при медленной акклимации (см. табл. 2). Также, в отличие от МГДГ, в акклимационных изменениях ЖК состава ДГДГ участвовало большинство ЖК. Так, содержание обеих мажорных ЖК (18:4 n-3 и 20:5 n-3) изменялось в результате акклимации и акклиматизации в том же направлении, что и суммарные показатели, а уровень остальных ЖК (14:0, 16:0, 18:1 n-9 и 18:2 n-6), наоборот, повышался при быстрой ак-климации, что, тем не менее, совпадало с акклиматизационным трендом для этих ЖК, а затем снижался при медленной акклимации. В процессе аккли- 142 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. мации не принимали участия две минорные ЖК (16:1 n-7 и 18:0), содержание которых, однако, резко возрастало в летний период, и а -линоленовая кислота 18:3 n-3, уровень которой мало изменялся как при акклимации, так и при акклиматизации сахарины японской. Таблица 2 [Table 2] ЖК состав ДГДГ Saccharina japonica в зависимости от скорости акклимации (% от суммы ЖК) [FA composition of DGDG of Saccharina japonica depending on the rate of thermal acclimation (% of the total FAs)] ЖК [FAs] Зима [Winter] Быстрая акклимация [Rapid acclimation], 16°C/day Медленная акклимация [Slow acclimation], 2°C/day Лето [Summer] 14:0 6,1 ± 0,2a 8,3 ± 0,5b 2,9 ± 0,1c 9,8 ± 0,3d 16:0 5,4 ± 0,3a 11,1 ± 0,2b 4,9 ± 0,2a 17,4 ± 0,4c 18:0 0,4 ± 0,1a 1,1 ± 0,2b 0,9 ± 0,3b 22,3 ± 0,2c 16:1 n-7 0,6 ± 0,2a 1,0 ± 0,3a 0,7 ± 0,1a 3,6 ± 0,1b 18:1 n-9 1,8 ± 0,1a 5,5 ± 0,4b 2,9 ± 0,3c 15,3 ± 0,5d 18:2 n-6 2,2 ± 0,4a 4,3 ± 0,2b 2,5 ± 0,2a 11,9 ± 0,2c 18:3 n-3 6,8 ± 0,1a 6,5 ± 0,3a 5,2 ± 0,4b 5,7 ± 0,3b 18:4 n-3 41,3 ± 0,5a 33,5 ± 0,4b 39,4 ± 0,2c 3,5 ± 0,3d 20:5 n-3 33,3 ± 0,2a 24,1 ± 0,2b 35,6 ± 0,6c 3,7 ± 0,1d НЖК [SFA] 12,2 ± 0,2a 20,8 ± 0,3b 8,6 ± 0,2c 30,8 ± 0,3d МНЖК [MUFA] 2,4 ± 0,1a 8,0 ±0,2b 4,2 ± 0,2c 40,3 ± 0,4d ПНЖК [PUFA] 85,4 ± 0,3a 71,2 ± 0,3b 87,2 ± 0,3c 28,9 ± 0,3d n-3 ПНЖК [n-3 PUFA] 81,4 ±0,2a 64,0 ± 0,3b 80,3 ± 0,5c 12,8 ± 0,2d n-6 ПНЖК [n-6 PUFA] 3,4 ± 0,3a 5,8 ± 0,2b 5,5 ± 0,3b 16,1 ± 0,1c n-3/n-6 ПНЖК [n-3/n-6 PUFA] 24,0 ± 0,3a 11,1 ± 0,3b 14,5 ± 0,3c 0,8 ± 0,2d ИН [UI] 363,4 ± 0,2a 295,7 ± 0,4b 372,2 ± 0,3c 128,4 ± 0,3d Ненасыщ. / насыщ. [UFA/SFA] 7,2 ± 0,2a 3,8 ± 0,3b 10,6 ± 0,2c 2,2 ± 0,2d Изменения в ЖК составе СХДГ, который является самым насыщенным гликолипидом, оказались подобными таковым в ДГДГ (см. табл. 3): также наблюдался зигзагообразный характер акклимационных изменений суммарных параметров (ИН и ненасыщенные / насыщенные ЖК), но в более сглаженном виде за счет того, что их значения снижались при обеих скоростях акклимации относительно уровня в зимний период. Этому тренду соответствовали изменения в содержании мажорных ПНЖК 18:3 n-3, 18:4 n-3 и 20:5 n-3, тогда как уровень доминирующей насыщенной ЖК (НЖК) 16:0 изменялся противоположным образом. Соотношение n-3/n-6 ПНЖК также изменялось зигзагообразно, но его величина немного возрастала при быстрой акклимации, а при медленной практически возвращалась к значению в зимний период. В целом акклимационные и акклиматизационные из- Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 143 менения всех трех параметров происходили в одном направлении, характеризующемся снижением их уровней относительно зимних значений. Также необходимо отметить, что для медленной акклимации характерен эффект повышения ИН и соотношения ненасыщенные / насыщенные ЖК по сравнению с уровнем этих параметров у всех трёх фотосинтетических гликолипидов S. japonica, акклимированной сравнительно быстро. Таблица 3 [Table 3] ЖК состав СХДГ Saccharina japonica в зависимости от скорости акклимации (% от суммы ЖК) [FA composition of SQDG of Saccharina japonica depending on the rate of thermal acclimation (% of the total FAs)] ЖК [FAs] Зима [Winter] Быстрая акклимация [Rapid acclimation], 16 °C/ day Медленная акклимация [Slow acclimation], 2 °C/day Лето [Summer] 14:0 2,5 ± 0,1а 3,3 ± 0,2b 22 ± 0,5а 3,8 ± 0,4b 16:0 25,5 ± 0,3а 37,1 ± 0,1b 34,1 ± 0,2c 47,3 ± 0,1d 18:0 0,6 ± 0,3а 1,0 ± 0,3а 1,2 ± 0,4а 4,5 ± 0,3b 16:1 n-7 0,2 ± 0,1а 0,3 ± 0,2а 0,2 ± 0,1а 3,8 ± 0,4b 18:1 n-9 15,7 ± 0,5а 20,8 ± 0,1b 18,1 ± 0,3c 22,9 ± 0,1d 18:2 n-6 4,9 ± 0,1а 27 ± 0,2b 3,4 ± 0,2c 8,1 ± 0,3d 18:3 n-3 21,5 ± 0,2а 10,2 ± 0,4b 13,0 ± 0,4c 3,1 ± 0,2d 18:4 n-3 13,3 ± 0,3а 12,1 ± 0,2b 13,1 ± 0,5а 0,9 ± 0,1c 20:5 n-3 12,8 ± 0,4а 9,8 ± 0,3b 11,8 ± 0,3c 1,5 ± 0,2d НЖК [SFA] 28,6 ± 0,3а 41,5 ± 0,2b 37,1 ± 0,3c 54,9 ± 0,2d МНЖК [MUFA] 16,4 ± 0,3а 22,1 ± 0,1b 19,5 ± 0,2c 27,4 ± 0,3d ПНЖК [PUFA] 55,0 ± 0,4а 36,4 ± 0,3b 43,4 ± 0,3c 17,7 ± 0,2d n-3 ПНЖК [n-3 PUFA] 47,6 ± 0,2а 32,1 ± 0,3b 37,9 ± 0,4c 5,5 ± 0,2d n-6 ПНЖК [n-6 PUFA] 6,5 ± 0,1а 3,6 ± 0,2b 4,9 ± 0,2c 12,1 ± 0,3d n-3∕n-6 ПНЖК [n-3∕n-6 PUFA] 7,3 ± 0,2а 8,9 ± 0,3b 7,7 ± 0,3а 0,5 ± 0,2d ИН [UI] 213,9 ± 0,5а 158,5 ± 0,2b 182,1 ± 0,3c 79,5 ± 0,2d Ненасыщ./насыщ. [UFA∕SFA] 2,5 ± 0,3а 1,4 ± 0,2b 1,7 ± 0,2b 0,8 ± 0,3c В целом ГЖХ анализ показал, что изменения в ЖК составе (ИН, соотношения n-3/n-6 ПНЖК и ненасыщенные / насыщенные ЖК) МГДГ быстро и особенно медленно акклимированной S. japonica противоположны тенденциям, которые наблюдались при смене сезона от зимы к лету. Направление акклимационных изменений в ЖК составе ДГДГ и СХДГ частично совпадало с акклиматизационным трендом. При этом быстрая акклимация вызывала более адекватный ответ, чем медленная. Вероятно, при быстрой акклимации срабатывают стрессовые механизмы адаптации, которые становятся неффективными или менее эффективными при понижении скорости акклимациии. Так как МГДГ является основным липидом S. japonica, на 144 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. долю которого приходится примерно 50% от суммы гликолипидов [25], то полученные результаты свидетельствуют об очень ограниченной способности S. japonica перестраивать ЖК состав липидного матрикса тилакоидных мембран при исследованных скоростях тепловой акклимации. Термотропное поведение и молекулярные виды гликолипидов S. japo-nica. Эффективность адаптивных перегруппировок в составе ЖК остатков гликолипидов S. japonica при тепловой акклимации оценивали по калориметрическому переходу из кристаллического состояния в оптимальное для функционирования мембран жидкокристаллическое состояние (см. рис. 1). Исследование ДСК переходов МГДГ сахарины японской подтвердило ранее полученный результат [14] о неадекватном поведении этого гликолипида при смене сезона от зимы к лету с точки зрения классического представления о гомеовязкостной адаптации [10]: Tmax смещалась с -10°С в более низкотемпературную область (до -34°С), несмотря на снижение ИН. При этом в области высоких температур дополнительные пики при 20 и 44°С оставались, но их интенсивность резко снижалась (см. рис. 1, а). Более детальный анализ ЖК состава, а именно анализ молекулярных видов (см. табл. 4) показал, что при тепловой акклиматизации происходило увеличение уровня наиболее ненасыщенных форм: мононенасыщенные ЖК (МНЖК) / ПНЖК, а также основных форм ПНЖК / ПНЖК, тогда как содержание более насыщенной формы НЖК / ПНЖК падало почти в 4 раза. Снижению Tmax также могло способствовать уменьшение соотношения n-3/n-6 ПНЖК, то есть увеличение доли n-6 ПНЖК в летний период, которые способствует большему понижению Tmax, чем более ненасыщенные n-3 ПНЖК [26]. При быстрой тепловой акклимации содержание НЖК / ПНЖК снижалось мягче (в 1,4 раза), что, вероятно, способствовало усилению фазового разделения липида, характеризовавшегося наличием двух главных пиков, примерно одинаковых по интенсивности: низкотемпературного пика при -22°С и высокотемпературного пика при 38°С. Снижение скорости аккли-мации в 8 раз привело к сдвигу Tmax низкотемпературного пика до -46°С, т.е. к его лучшей подгонке к основному пику ДСК перехода летнего образца, чему способствовало увеличение ИН и соотношения ненасыщенные / насыщенные ЖК (см. табл. 1). Известно, что МГДГ, являясь основным по содержанию липидом тилакоидных мембран, играет решающую роль в структурной гибкости макроансамблей светособирающего комплекса II (CCKII), ΦCII и ФСІ, цит. b6∕fH CFθCFJ-АTФазы в хлоропластах [12, 19]. В связи с этим важно отметить, что расположение значительной части термограммы зимнего образца МГДГ S. japonica при температурах выше 4°С свидетельствует о присутствии большой доли липида в кристаллическом состоянии в зимнее время, тогда как калориметрический переход летнего образца МГДГ, практически полностью осуществляющийся в области ниже 20°С, указывает на жидкокристаллическое состояние превалирующей части этого липида в летнее Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 145 время. Таким образом, более вязкое состояние основного липида тилакоидных мембран в зимнее время может способствовать более низкой активности фотосинтетических комплексов. Летом, наоборот, активность может возрастать благодаря более подвижному состоянию тилакоидных мембран. Поддержание жидкокристаллического состояния липидного матрикса тилакоидных мембран особенно важно для эффективной замены повреждённых белков реакционного центра ФСІІ, главн^ім образом D1. Такая замена протекает путем диссоциации ФСІІ на два мономера путём их латеральной диффузии [27-28]. Так как МГДГ находится в зоне контакта мономеров ФСІІ, то повышенная вязкость этого гликолипида может замедлять данный процесс и тем самым быть причиной низкотемпературного ингибирования фотосинтеза в зимний период. ---- Лето [SummerJ Зима [Winter] Рис. 1. Типичные ДСК термограммы гликолипидов МГДГ (a), ДГДГ (b), СХДГ (c) Saccharina japonica в зависимости от скорости тепловой акклимации (16 и 2°С/сут) и от сезона (лето и зима). Вертикальная линия - 1 мВт. Скорость сканирования -16°С/мин. Вес образца - 10 мг. Каждый образец сканировали минимум 3 раза [Fig. 1. Typical DSC thermograms of glycolipids MGDG (a), DGDG (b), SQDG (c) of Saccha-rina japonica depending on the rate of thermal acclimation (16 and 2°C/d) and season (summer and winter). The vertical bar - 1 mW. Scanning rate is 16°C/min. Sample weight is 10 mg. Each sample was scanned at least 3 times] 146 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. Таблица 4 [Table 4] Состав молекулярных видов МГДГ Saccharina japonica при прогреве морской воды (% от суммы молекулярных видов) [Molecular species composition of MGDG of Saccharina japonica when heating seawater (% of the total molecular species)] Молекулярные виды [Molecular species] Зима [Winter] Быстрая акклимация [Rapid ac -climation], 16°C/day Медленная акклимация [Slow acclimation], 2°C/day Лето [Summer] 14:0/18:1 5,8 ± 0,2a 6,6 ± 0,1b 7,5 ± 0,7c 6,0 ± 0,1a 16:0/18:1 3,4 ± 0,1a 4,1 ± 0,3b 3,4 ± 0,3a 5,3 ± 0,2c 14:0/18:2 6,8 ±0,3a 6,5 ± 0,5a 4,8 ± 0,5b 1,6 ± 0,1c 16:0/18:2 3,5 ± 0,2a 4,3 ± 0,3b 4,2 ± 0,1b 2,3 ± 0,4c 14:0/18:3 5,3 ± 0,2a 3,6 ± 0,1b 1,9 ± 0,3c 0,3 ± 0,3d 16:0/18:3 3,3 ± 0,4a 2,4 ± 0,2b 1,7 ± 0,2c 0,8 ± 0,1d 14:0/18:4 3,7 ± 0,1a 0,7 ± 0,2b 0,8 ± 0,1b 0,2 ± 0,1c 16:0/18:4 3,4 ± 0,3a 1,1 ± 0,3b 1,2 ± 0,2b 0,9 ± 0,2b 18:2/20:5 1,2 ± 0,1a 1,2 ± 0,1a 2,3 ± 0,2b 4,7 ± 0,3c 18:3/18:4 7,3 ± 0,6a 7,4 ± 0,3a 5,9 ± 0,3b 4,4 ± 0,4c 18:4/18:4 31,2 ± 0,2a 21,1 ± 0,2b 19,2 ± 0,1c 7,4 ± 0,3d 18:4/20:4 1,0 ± 0,1a 2,0 ± 0,2b 2,6 ± 0,3c 9,7 ± 0,2a 18:4/20:5 10,5 ± 0,2a 14,7 ± 0,4b 14,6 ± 0,2b 12,5 ± 0,1c НЖК/НЖК [SFA/SFA] - - 0,2 ± 0,1a 0,1 ± 0,1a НЖК/МНЖК [SFA/MUFA] 9,6 ± 0,3a 11,8 ± 0,2b 12,4 ± 0,2c 12,6 ± 0,3c НЖК/ПНЖК [SFA/PUFA] 26,4 ±0,2a 19,7 ± 0,3b 15,7 ± 0,2c 7,2 ± 0,2d МНЖК/МНЖК [MUFA/MUFA] 0,3 ± 0,1a 0,4 ± 0,3a 0,9 ± 0,1b 1,4 ± 0,1c МНЖК/ПНЖК [MUFA/PUFA] 2,5 ± 0,2a 3,2 ± 0,1b 5,0 ± 0,3c 11,1 ± 0,3d ПНЖК/ПНЖК [PUFA/PUFA] 61,2 ± 0,4a 64,9 ± 0,2b 65,8 ± 0,2c 67,6 ± 0,3d Примечание. Молекулярные виды, процентное содержание которых во всех четырёх экспериментальных группах ниже 3%, в таблице не представлены, но учтены при расчетах общих параметров. НЖК, МНЖК, ПНЖК - насыщенн^те, мононенасыщенн^те, полине-насыщенн^те ЖК соответственно. «-» - не обнаружено; сл. - следовые количества (содержание ниже 0,1%). Представлены средние значения ± доверительный интервал, n=9. Надстрочные латинские буквы обозначают статистическую значимость различий средних значений при р ≤ 0,05 по содержанию каждого молекулярного вида / формы. [Note. Molecular species with content lower than 3% in four experimental groups are excluded but considered in calculations of total parameters. SFA, MUFA and PUFA are saturated, monounsaturated and polyunsaturated FAs, respectively. «-» is not detected; tr. is traces (content less than 0.1%). Mean values ± confidence interval, n = 9, are given. Superscript Latin letters denote the statistical significance of differences in mean values for p ≤ 0.05 in the content of each molecular species/form]. Так как при обеих скоростях акклимации наблюдался интенсивный пик калориметрического перехода в области 40°С, то выбранное время прогрева мор- Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 147 ской воды оказалось недостаточным для достижения наиболее функционально активного состояния главного липида тилакоидных мембран S. japonica. Термограммы зимних образцов МГДГ и ДГДГ характеризовались сходными профилями и близкими по положению главным и дополнительным менее интенсивн^ім пиками в области -10 и 25°С соответственно. Но в отличие от сезонного изменения термотропного поведения неламеллярного МГДГ, Тmaχ ламеллярного ДГДГ адекватно повышалась на 10°С, а температурный интервал калориметрического перехода расширялся на 30°С за счет высокотемпературной области при смене сезона от зимы к лету (см. рис. 1, b). Этому, вероятно, способствовало резкое падение ИН и соотношения ненасыщенные / насыщенные ЖК при увеличении содержания наиболее насыщенной формы НЖК / МНЖК в 4 раза и, наоборот, уменьшения вклада самой ненасыщенной формы ПНЖК / ПНЖК в 1,5 раза. Интересно, что содержание двух других молекулярных форм МНЖК / ПНЖК и НЖК / ПНЖК также изменялось противоположным образом (см. табл. 5). Таблица 5 [Table 5] Состав молекулярных видов ДГДГ Saccharina japonica при прогреве морской воды (% от суммы молекулярных видов) [Molecular species composition of DGDG of Saccharina japonica when heating seawater (% of the total molecular species)] Молекулярные виды [Molecular species] Зима [Winter] Быстрая акклимация [Rapid acclimation], 16°C/day Медленная акклимация [Slow acclimation], 2°C/day Лето [Summer] 14:0/18:1 3,4 ± 0,2a 3,7 ± 0,3a 2,6 ± 0,1b 6,4 ± 0,3c 16:0/18:1 сл. [tr.] 1,1 ± 0,2a 0,6 ± 0,3a 6,3 ± 0,1b 14:0/18:2 4,5 ± 0,1a 6,4 ± 0,3b 2,8 ± 0,2c 2,4 ± 0,4c 14:0/18:3 6,0 ± 0,3a 5,8 ± 0,1a 2,3 ± 0,3b 1,2 ± 0,2c 16:0/18:3 4,7 ± 0,4a 2,4 ± 0,2b 0,4 ± 0,2c 2,7 ± 0,1b 14:0/18:4 3,9 ± 0,3a 1,1 ± 0,2b 0,5 ± 0,2c 0,3 ± 0,1c 16:0/18:4 5,1 ± 0,2a 0,5 ± 0,1b 0,2 ± 0,2b 0,8 ± 0,4b 16:1/20:5 сл. [tr.] сл. [tr.] сл. [tr.] 7,6 ± 0,2a 18:2/20:5 0,1 ± 0,1a 0,1 ± 0,1a 1,8 ± 0,3b 8,5 ± 0,3c 18:3/20:5 сл. [tr.] сл. [tr.] сл. [tr.] 6,3 ± 0,4a 18:4/18:4 0,5 ± 0,2a 4,6 ± 0,3b 5,2 ± 0,4b 0,6 ± 0,3a 18:4/20:4 4,1 ± 0,5a 5,6 ± 0,2b 8,9 ± 0,2c 10,7 ± 0,2d 18:4/20:5 63,1 ± 0,6a 63,3 ± 0,2a 69,0 ± 0,3b 14,9 ± 0,3c НЖК/НЖК [SFA/SFA] - - - 0,3 ± 0,1a НЖК/МНЖК [SFA/MUFA] 3,6 ± 0,2a 5,5 ± 0,4b 3,4 ± 0,3a 15,3 ± 0,3c НЖК/ПНЖК [SFA/PUFA] 25,7 ± 0,1a 18,3 ± 0,1b 7,6 ± 0,2c 13,8 ± 0,2d МНЖК/МНЖК [MUFA/MUFA] - сл. [tr.] 1,3 ± 0,1a МНЖК/ПНЖК [MUFA/PUFA] 0,3 ± 0,1a 0,2 ± 0,1a 1,3 ± 0,3b 17,3 ± 0,3c ПНЖК/ПНЖК [PUFA/PUFA] 70,4 ± 0,3a 76,0 ± 0,2b 87,7 ± 0,2c 52,1 ± 0,1d Примечание. См. табл. 4. [Note. See Table 4]. 148 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. Эффекты быстрой и медленной акклимации на термотропное поведение ДГДГ оказались противоположными. Если при быстрой акклимации максимум теплопоглощения приходился на 30°С (т.е. на существенно более высокую температуру, чем летом), то при медленной акклимации наблюдалась термограмма, подобная таковой зимнего образца ДГДГ, но Tmax наблюдался при еще более низкой температуре (-35°С). Это коррелировало с зигзагообразным характером зависимости суммарных параметров ЖК состава ДГДГ (ИН, ненасыщенные / насыщенные ЖК и n-3/n-6 ПНЖК), которые значительно снижались при быстрой акклимации. Это совпадало с направлением изменений ЖК состава ДГДГ при смене сезона от зимы к лету. При медленной аккли-мации значения возрастали и даже превосходили исходный уровень. Среди молекулярных форм в наибольшей степени изменялось содержание форм НЖК / ПНЖК и в меньшей степени ПНЖК / ПНЖК. Причем уровень НЖК / ПНЖК последовательно снижался при быстрой, а затем при медленной ак-климации в соответствии с трендом тепловой акклиматизации, а содержание ПНЖК / ПНЖК также последовательно увеличивалось при акклимации в противоположность сезонным изменениям. Несоответствие сезонных изменений термотропного поведения СХДГ S. japonica, подобно МГДГ, классическим представлениям о гомеовязкост-ной адаптации совпадает с ранее полученными результатами [14]. Понижение Tmax СХДГ от зимы к лету сопровождалось резким снижением содержания формы ПНЖК / ПНЖК в 10 раз и возрастанием уровня НЖК / МНЖК в 2 раза. Возможно, высокая ненасыщенность n-3 ПНЖК (18:3 n-3, 18:4 n-3 и 20:5 n-3), входящих в состав форм ПНЖК / ПНЖК, способствует более плотной упаковке молекул СХДГ благодаря структурной гибкости ПНЖК, заполняющих пустоты между одноименно заряженными молекулами. Поэтому драматическое снижение уровня этих молекулярных видов летом может быть главной причиной разрыхления упаковки СХДГ при тепловой акклиматизации S. japonica, несмотря на снижение ИН и соотношения ненасыщенные / насыщенные (см. рис. 1, c; табл. 6). Однако при тепловой ак-климации место молекулярной формы НЖК / МНЖК, содержание которой в этом случае мало изменялось, занимала молекулярная форма НЖК / ПНЖК. Но ее уровень повышался, а содержание ПНЖК/ПНЖК снижалось примерно в одинаковой степени (в 2 и 1,5-1,7 раза соответственно) при разных скоростях акклимации. В результате термограммы СХДГ из акклимированных водорослей также сходным образом смещались в сторону температур ниже 0°С и даже более эффективно по сравнению с сезонными изменениями. При этом также наблюдалось усложнение профиля термограмм и соответствующее усиления фазового разделения гликолипида. Снижение скорости аккли-мации приводило к перераспределению интенсивностей пиков, направленному на усиление наиболее близко расположенных к Tmax летнего образца СХДГ. max Влияние скорости тепловой акклимации на жирнокислотный состав 149 Таблица 6 [Table 6] Состав молекулярных видов СХДГ Saccharina japonica при прогреве морской воды (% от суммы молекулярных видов) [Molecular species composition of SQDG of Saccharina japonica when heating seawater (% of the total molecular species)] Молекулярные виды [Molecular species] Зима [Winter] Быстрая акклимация [Rapid acclimation], 16°C/ day Медленная акклимация [Slow acclimation], 2°C/day Лето [Summer] 14:0/18:1 0,3 ± 0,2a 2,9 ± 0,1b 3,8 ± 0,4c 4,9 ± 0,3d 16:0/18:1 357 ± 0,3a 297 ± 0,3b 297 ± 0,2b 63,9 ± 0,4c 16:0/18:2 4,0 ± 0,1a 57 ± 0,3b 7,2 ± 0,3c 10,0 ± 0,2d 16:0/18:3 7.2 ± 0,2a 19,0 ± 0,4b 21,2 ± 0,1c 6,8 ± 0,3a 18:3/18:4 5,8 ± 0,2a 4,7 ±0,2b 3,8 ± 0,3c 0,6 ± 0,1d 18:4/20:5 40,6 ± 0,5a 23,5 ± 0,3b 21,1 ± 0,2c 1,0 ± 0,3d НЖК/НЖК [SFA/SFA] - 1,7 ± 0,2a 2,6 ± 0,1b 3,5 ± 0,2c НЖК/МНЖК [SFA/MUFA] 36,1 ± 0,3a 33,3 ± 0,3b 34,3 ± 0,2c 70,7 ± 0,2d НЖК/ПНЖК [SFA/PUFA] 14,5 ± 0,2a 31,2 ± 0,3b 33,9 ± 0,2c 19,9 ± 0,3d МНЖК/МНЖК [MUFA/MUFA] сл. [tr.] сл. [tr.] 0,2 ± 0,1a МНЖК/ПНЖК [MUFA/PUFA] - 0,5 ± 0,2a 0,5 ± 0,1a 0,8 ± 0,3a ПНЖК/ПНЖК [PUFA/PUFA] 49,4 ± 0,4a 33,3 ± 0,3b 28,7 ± 0,2c 4,9 ± 0,2d Примечание. См. табл. 4. [Note. See Table 4]. Предполагалось, что одна из главных функций СХДГ - замещение анионного липида фосфатидилглицерола (ФГ) в фотосинтетических мембранах в условиях недостатка фосфатов для поддержания отрицательного заряда [29]. Однако выяснилось, что для поддержания нормального образования тилакоидных мембран и работы ФСІІ эти два липида не являются взаимозаменяемыми [30-31]. СХДГ вместе с МГДГ обнаружены в структурах фотосинтетических комплексов в качестве кофакторов, в частности, в зоне контакта мономеров ФСІІ. Разделение фаз, характерное для термотропного поведения всех исследованных гликолипидов, возможно, необходимо для обеспечения более вязкой среды для ФСІІ, сконцентрированных в гранальных тилакоидных мембранах, и более подвижной в стромальных мембранах, где преобладает ФСІ [32-33]. Полученные результаты показали, что при разных скоростях тепловой акклимации наблюдается начальный этап подгонки профиля термограмм гликолипидов к таковому летних образцов, сопровождающийся усилением фазового разделения гликолипидов. Однако выявленные изменения скорее можно расценивать как тенденцию: выбранного времени тепловой аккли- 150 М.Ю. Баркина, Л.А. Помазёнкова, Н.С. Чопенко и др. мации оказалось недостаточно для явных сдвигов в профиле термограмм гликолипидов, приближающих их к структуре термограмм летних образцов. Неявный и даже неоднозначный характер акклимационных изменений термотропного поведения основных компонентов липидного матрикса S.japonica, возможно, связан с тем, что данный вид является холодолюбивым [4]. Эти водоросли обитают на глубине и не подвергаются в естественных условиях частым перепадам температуры в широком диапазоне [34]. Поэтому S. japonica, вероятно, лишена эффективных приспособительных механизмов регуляции физического состояния липидного матрикса мембран в условиях резкого повышения температуры окружающей среды. В результате наблюдаемые изменения тепловых переходов и связанного с ними ЖК состава гликолипидов S. japonica носили стрессовый характер. Заключение Тепловая акклимация S. Japonica от 4 до 20°С показала, что параметры ненасыщенности (ИН и соотношение ненасыщенные/насыщенные ЖК) ЖК состава основного гликолипида водоросли МГДГ увеличивались по сравнению с их значениями в зимний период в противоположность акклиматизационному тренду при смене сезона от зимы к лету. Повышение этих параметров усиливалось при снижении скорости тепловой акклимации с 16 до 2°С/сут. Соотношение n-3/n-6 ПНЖК, которое уменьшается при тепловой акклиматизации в полярных липидах морских макрофитов, мало изменялось в МГДГ и СХДГ S. japonica ни при быстрой, ни при медленной акклимации. Только в ДГДГ соотношение п-З/п-б ПНЖК уменьшалось в соответствии с сезонным трендом, особенно при быстрой акклимации. В отличие от МГДГ, параметры ненасыщенности ЖК состава ДГДГ и СХДГ снижались при быстрой акклимации. При медленной акклимации изменения ненасыщенности ослаблялись или носили противоположный характер в СХДГ и ДГДГ со-оответственно. Результатом тепловой акклимации явилось усиление фазового разделения гликолипидов, которое можно рассматривать как начальный этап подгонки профиля термограмм гликолипидов к таковому летних образцов. Вероятно, выбранные скорости тепловой акклимации слишком высокие для проявления более четких изменений термотропного поведения основных липидов тилакоидных мембран, соответствующих сезонным трендам. Причиной неоднозначного, стрессового характера изменений ЖК состава и калориметрических переходов гликолипидов S. Japonica при тепловой акклимации, вероятно, являются холодолюбивость и отсутствие резких колебаний температуры в естественных условиях обитания этого вида морских макроводорослей.

Скачать электронную версию публикации