Genetic diversity and differentiation of Pinus sylvestris L. cenopopulations growing in bog land and upland ecoto.pdf Введение Одной из ключевых проблем биологии является изучение механизмов формирования внутривидовой изменчивости, в том числе механизмов образования популяционной структуры видов под воздействием гетерогенных условий окружающей среды. Для изучения экологических механизмов дивергенции популяций у древесных видов большой интерес представляет О.В. Шейкина, Ю.Ф. Гладков 102 сосна обыкновенная (Pinus sylvestris L.), которая, обладая высокой экологической пластичностью, формирует ценопопуляции в различных почвенно-гидрологических условиях. С целью изучения влияния экологических факторов на фенотипическую и генетическую дифференциацию популяций для исследований часто выбирают систему контрастных объектов «болото - суходол». Между болотными и суходольными древостоями сосны обыкновенной ранее выявлены различия по размеру пыльцевых зерен [1], окраске микростробил и семян [2], числу нераскрывающихся макростробил [3]. Установлено, что для деревьев из болотных популяций разных видов Pinacea характерны большее число вторичных перетяжек и ядрышек в интерфазных ядрах, наличие широкого спектра хромосомных мутаций и патологий по сравнению с деревьями из суходольных популяций [4]. На основе анализа изоферментов выявлены генетический полиморфизм и наличие репродуктивного барьера между болотными и суходольными популяциями [5, 6]. Предполагается, что фенотипическая и генетическая дифференциация болотных и суходольных популяций сосны обыкновенной являются следствием совместного действия репродуктивной изоляции и дизруптивного отбора в условиях контрастных экотопов [7]. Причиной возникновения репродуктивной изоляции между смежными суходольными и болотными насаждениями сосны обыкновенной в условиях Средней Сибири и Русской Равнины является стабильная асинхронность фенологических фаз пыления и рецепции деревьев, вызванная различиями в гидротермических режимах почвы [6]. Таким образом, полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о существование фенотипической и генетической дифференциации между популяциями сосны обыкновенной, произрастающими в болотных и суходольных экотопах. Однако необходимо отметить, что до сих пор для изучения влияния почвенно-гидрологических условий на генетическую дифференциацию популяций древесных видов в основном применялся анализ полиморфизма продуктов экспрессии генов (изоферментов). В то же время в последнее десятилетие ДНК-маркеры стали общепризнанным инструментарием для проведения популяционно-генетических исследований. Поэтому необходимы исследования, направленные на изучение механизмов формирования популяционной структуры древесных растений с использованием более информативных методов молекулярно-генетического анализа, позволяющих выявлять различия на уровне ДНК. Цель работы - изучить показатели генетического разнообразия и дифференциации ценопопуляций сосны обыкновенной, произрастающих в контрастных болотных и суходольных условиях на основе использования ISSR-маркеров. Материалы и методики исследования Исследования проведены на территории Республики Марий Эл, находящейся в среднем течении р. Волга на территории Среднего Поволжья. Генетическое разнообразие и дифференциация ценопопуляций сосны 103 Среднее Поволжье расположено в Европейской части России между 54° и 58° с.ш. и между 44° и 52° в.д. В качестве объектов исследования подобраны две группы ценопопуляций сосны обыкновенной, произрастающие на песчаных почвах с разным режимом увлажнения на территории четырех лесничеств (табл. 1). Первая группа ценопопуляций представляла собой четыре суходольных насаждения, произрастающие на сухих и влажных песках. Возраст суходольных насаждений варьировал от 50 до 90 лет. Суходольные насаждения представлены сосняком лишайниковым (III класс бонитета), брусничным (I класс бонитета) и лишайниково-брусничным (II класс бонитета). Вторая группа ценопопуляций включала три насаждения сосны обыкновенной, сформированные на верховых болотах. Все болотные насаждения, сформированные в типе условия произрастания А5, представляли собой сосняк сфагновый (V класс бонитета). Для изученных болот характерен практически сплошной сфагновый покров, состоящий из нескольких видов сфагнума. Все ценопопуляции представляли собой либо чистые насаждения сосны обыкновенной, либо доля участия данного вида составляла 90%. С учетом того, что наиболее интенсивное изреживание древостоев в ходе естественного отбора у сосны обыкновенной наблюдается в возрасте до 40 лет, для исследований подобраны ценопопуляции возраста 40 лет и выше. Все насаждения находились на территории Республики Марий Эл, сформированы в однородных климатических условиях. В каждой из ценопопуляций для молекулярно-генетического анализа отобрано по 30 деревьев, произрастающих на расстоянии не менее 40-50 м друг от друга. ДНК для анализа генетического полиморфизма выделена из камбиального слоя ствола с использованием СТАВ-метода [8]. Для выявления генетической изменчивости и дифференциации ценопопуляций применен ISSR-анализ с праймерами (СА)^СТ, (GA),AG, (CA)6GT, (CA)6AC, (AG)8T и (AG)8GCT [9]. Для амплификации ДНК с ISSR-праймерами использована следующая реакционная смесь общим объемом 10 мкл: 1 мкл ПЦР-буфера; 0,2 мкл 10 мМ dNTPs; 0,1 мкл 100мкМ праймера; 1 мкл образца ДНК; 0,1 мкл Taq-полимеразы (2 ед/ мкл); 7,6 мкл воды. Режим ПЦР: 5 мин денатурация при 94°С, 35 циклов: 0,5 мин денатурация при 94°С, 45 с отжиг при 60°С, элонгация 45 с при 72°С, финальная элонгация в течение 7 мин при 72°С. ПЦР выполнена с использованием коммерческого набора Encyclo Plus PCR kit (ЗАО «Евроген», Россия) и термоциклера MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Визуализация результатов ПЦР проведена путем электрофореза в 1,5% агарозном геле в ТВЕ буфере. Фиксирование результатов и обработка данных выполнены с использованием системы гель-документирования GelDoc 2000 (Bio-Rad, США) и программного пакета Quantity One® Version 4.6.3. Длины обнаруженных амплифицированных фрагментов ДНК рассчитаны по отношению к маркеру длин ДНК «100+ bp DNA Ladder» (ЗАО «Евроген», Россия). На основе анализа электрофореграмм составлены бинарные матрицы, в которых присутствующие ПЦР-фрагменты обозначались «1» (аллель 1), а отсутствующие «0» (аллель 0). О.В. Шейкина, Ю.Ф. Гладков 104 Таблица 1 [Table 1] Местонахождение и характеристика ценопопуляций сосны обыкновенной в Республики Марий Эл [Location and characteristics of the Pinus sylvestris L. coenopopulations in the Mari El Republic] Шифр ценопопуляции [Coenopopu-lation code] Местонахождение [Location] Возраст, лет [А№ year] Состав [Stand compo sition] Полнота / бонитет [Stand density / bonitet] Тип леса [Forest type] Тип условий произрастания / почвы [Forest growth conditions / soil] Суходольные ценопопѵляттии [Upland coenopopulations] UOL Учебно-опытное лесничество, квартал 77 [Uchebno-Opytnoe forestry, forest compartment 77] 90 10Ps 0,9 / I бр [ling] А2 - влажный сосновый лес / влажный песок [Fresh coniferous forest / fresh sand] KL Килемарское лесничество, квартал 107 [Kilemarskoe forestry, forest compartment 107] 85 10Ps1Bp 0,8 / I бр [ling] А2 - влажный сосновый лес / влажный песок [Fresh coniferous forest / fresh sand] ML Моркинское лесничество, квартал 19 [Morkinskoe forestry, forest compartment 19] 50 10Ps 0,7 /III лш [lich] А1 - сухой сосновый лес / сухой песок [A - dry coniferous forest / dry sand] PL Пригородное лесничество, квартал 17 [Prigorodnoe forestry, forest compartment 17] 80 10Ps 0,7 / II лш-бр [ling-lich] A1A2 - переходный тип соснового леса / сухой-влажный песок [Transitional type of coniferous forest / sand-fresh sand] Болотные ценопопуляции [Bog land coenopopulations] Izi Kup Пригородное лесничество, квартал 17, болото «Изи Куп» [Prig-orodnoe forestry, bog Izi Kup, forest compartment 17] 60 10Ps 0,6 / V сфаг [sphag] A5 - сосновый лес на болотистых почвах / мокрый песок [Coniferous forest in boggy soil / wet sand] Ilushkino Пригородное лесничество, болото «Илюшкино» квартал 34 [Prigorodnoe forestry, bog Iluskino, forest compartment 34] 40 10Ps1Bp 0,7 / V сфаг [sphag] A5 - сосновый лес на болотистых почвах / мокрый песок [Coniferous forest in boggy soil / wet sand] Генетическое разнообразие и дифференциация ценопопуляций сосны 105 Продолжение табл. 1 [Table 1 (cont.)] Шифр ценопопуляции [Coenopopu-lation code] Местонахождение [Location] Возраст, лет [a№ year] Состав [Stand compo sition] Полнота / бонитет [Stand density / bonitet] Тип леса [Forest type] Тип условий произрастания / почвы [Forest growth conditions / soil] 45 km Пригородное лесничество, болото «45-й километр», квартал 3 [Prigorodnoe forestry, bog 45 km, forest compartment 3] 100 10Ps 0,8 / V сфаг [sphag] А5 - сосновый лес на болотистых почвах / мокрый песок [Coniferous forest in boggy soil / wet sand] Шифр ценопопуляции [Coenopopu-lation code] Местонахождение [Location] Возраст, лет [a№ years] Состав [Stand compo sition] Полнота / бонитет [Stand density / bonitet] Тип леса [Forest type] Тип условий произрастания / почвы [Forest growth conditions / soil] Суходольные ценопопуляттии [Upland cenopo pulations] UOL Учебно-опытное лесничество, квартал 77 [Uchebno-Opytnoe forestry, forest compartment 77] 90 10Ps 0,9 / I бр [ling] А2 - влажный сосновый лес / влажный песок [Fresh coniferous forest / wet sand] KL Килемарское лесничество, квартал 107 [Kilemarskoe forestry, forest compartment 107] 85 10Ps1Rp 0,8 / I бр [ling] А2 - влажный сосновый лес / влажный песок [Fresh coniferous forest / wet sand] ML Моркинское лесничество, квартал 19 [Morkinskoe forestry, forest compartment 19] 50 10Ps 0,7 /III лш [lich] А1 - сухой сосновый лес / сухой песок [A - dry coniferous forest / dry sand] PL Пригородное лесничество, квартал 17 [Prigorodnoe forestry, forest compartment 17] 80 10Ps 0,7 / II лш-бр [ling-lich] A1A2 -переходный тип соснового леса / сухой-влажный песок [Transitional type of coniferous forest / dry sand-wet sand] Болотные ценопопуляттии [Rog land cenopopulations] Izi Kup Пригородное лесничество, квартал 17, болото «Изи Куп» [Prig-orodnoe forestry, Izi Kup bog, forest compartment 17] 60 10Ps 0,6 / V сфаг [sphag] A5 - сосновый лес на болотистых почвах / мокрый песок [Coniferous forest in boggy soil / wet sand] О.В. Шейкина, Ю.Ф. Гладков Окончание табл. 1 [Table 1 (end)] Шифр ценопопуляции [Coenopopu-lation code] Местонахождение [Location] Возраст, лет [а№ year] Состав [Stand compo sition] Полнота / бонитет [Stand density / bonitet] Тип леса [Forest type] Тип условий произрастания / почвы [Forest growth conditions / soil] Ilushkino Пригородное лесничество, болото «Илюшкино» квартал 34 [Prigorodnoe forestry, Iluskino bog, forest compartment 34] 40 10Ps1Bp 0,7 / V сфаг [sphag] А5 - сосновый лес на болотистых почвах / мокрый песок [Coniferous forest in boggy soil / wet sand] [45 km] Пригордное лесничество, болото «45-й километр», квартал 3 [Prigorodnoe forestry, 45 km bog, forest compartment 3] 100 10Ps 0,8 / V сфаг [sphag] А5 - сосновый лес на болотистых почвах / мокрый песок [Coniferous forest in boggy soil / wet sand] Примечание'. Состав: Ps - сосНа обыкновенная Pinus sylvestis L., Bp - береза повислая Betula pendula Roth. Типы леса: бр - брусничный, лш - лишайниковый, бр-лш - бруснично-лишайниковый, сфаг - сфагновый. 106 [Note. Stand composition: Ps - Pinus sylvestis L., Bp - Betula pendula Roth. Forest type: ling - lingonberry, lich - lichen, ling-lich - lingonberry-lichen, sphag - sphagnum]. Расчет параметров генетической изменчивости и подразделённости ценопопуляций выполнен в программе POPGENE 1.31 [10]. Генетическая дифференциация ценопопуляций оценивалась на основе анализа генетической дистанции Нея [11] и «^.-статистики Нея [12]. Для оценки статистической значимости различий встречаемости аллелей использован %2-тест, различия считались статистически значимыми при p

Скачать электронную версию публикации