Induction of somatic embryogenesis in Siberian spruce (Picea obovata) in in vitro culture.pdf Сокращения [Abbreviations]: ECs - эмбриогенные культуры [Embryogenic cultures]; ESM - эмбрионально-суспензорная масса [Embryonic suspension mass]; CL - клеточная линия [Cell line]; 2,4-D - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота [2,4-dichlorophenoxyacetic acid]; BAP - 6-бензоаминопурина [N6-benzoaminopurine]. Для цитирования: Третьякова И.Н., Пак М.Э., Пахомова А.П., Шевелева И.С., Муратова Е.Н. Индукция соматического эмбриогенеза у ели сибирской (Picea obovata) в культуре in vitro // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2021. № 54. С. 6-20. doi: 10.17223/19988591/54/1 Индукция соматического эмбриогенеза у ели сибирской 7 Введение Ель сибирская (Picea obovata) - один из основных лесообразующих видов Сибири, произрастающий от районов северной Европы до Магаданской области. Ель сибирская имеет большое значение в лесоперерабатывающей промышленности, её применяют в защитном лесоразведении, создании снегозадерживающих полос, живых изгородей. Высокие стройные вечнозеленые деревья ели с густой мутовчатой конусовидной кроной перспективны для городского озеленения и ландшафтного дизайна, в особенности разновидности с голубоватой окраской хвои. Ель сибирская растет в жестких условиях резко континентального климата, в том числе на почвах с вечной мерзлотой, является теневыносливой [1]. Однако длительный репродуктивный цикл ели, как и других видов хвойных, нерегулярные урожаи - серьезное препятствие для размножения данного вида. Кроме того, традиционные методы размножения ели не решают проблемы воспроизводства элитных деревьев с необходимыми наследственными свойствами. Так, при семенном размножении только 4-6% деревьев приобретают необходимую окраску хвои, растения, полученные путем прививки, нередко наследуют болезни от взрослых деревьев [2]. Наиболее перспективное направление в размножении хвойных - технология соматического эмбриогенеза, которая позволяет не только массово тиражировать элитные генотипы деревьев, но и служит моделью для исследования структурных, физиологических и молекулярно-генетических механизмов как соматического, так и зиготического эмбриогенеза хвойных. Между тем именно у ели (Picea abies) впервые открыли соматический эмбриогенез в 1985 г. [3, 4]. Схема прохождения соматического эмбриогенеза также показана для Picea abies [5, 6]. К настоящему времени успешная регенерация через соматический эмбриогенез выявлена у разных видов ели: черной (P mariana) [7], белой (P glauca) [8], обыкновенной (P abies) [9, 10], голубой (P pugens) [11, 12], гибридной (P glauca х P engelmannii) [13]. До сих пор ученые разных стран проводят активные исследования по оптимизации протоколов соматического эмбриогенеза, изучению мультипликации зародышей [14], физиолого-биохимических [15, 16] и молекулярно-генетических процессов [17-23] соматического эмбриогенеза хвойных, в том числе видов ели. При этом каждый вид ели требует разработки своего протокола получения эмбриогенной культуры. Однако публикации о регенерации ели сибирской (P obovata) в культуре in vitro через соматический эмбриогенез до сих пор отсутствуют, что является серьезным препятствием для развития технологий размножения in vitro данного вида. В данной статье мы приводим разработку биотехнологии инициации соматического эмбриогенеза в культуре in vitro ели сибирской. Цель данного исследования - получить эмбриогенные культуры, продуцирующие соматические зародыши и эмбрионально-суспензорную массу Picea obovata. И.Н. Третьякова, М.Э. Пак, А.П. Пахомова и др. 8 Материалы и методики исследования Исследования проведены в 2014-2019 гг. на 30 деревьях ели сибирской, произрастающих в пригородах г. Красноярска (микрорайоны Академгород, Ветлужанка) и стационаре «Погорельский бор» ИЛ СО РАН (38 км от г. Красноярска). Для обнаружения компетентных к соматическому эмбриогенезу генотипов каждый год для эксперимента выбирали новые деревья-доноры. С каждого дерева собирали 3-10 шишек, которые до анализа хранили при 4±1 °C. Поверхность собранных шишек стерилизовали: промывали с мылом, обрабатывали 5%-ным раствором гипохлорита натрия, затем извлекали семена, собранные на разных стадиях эмбриогенеза - глобулярного зародыша, инициации семядолей, развития семядолей и зрелого зародыша. Поверхностная стерилизация семян проведена 10% раствором Н2О2 (ЗАО «Химреактивснаб», Россия) в течение 10 мин, затем семена однократно промывали стерильной дистиллированной водой в течение 10 мин. В асептических условиях зародыши извлекали из мегагаметофитов и инокулировали на питательные среды по 10 эксплантов на колбу в 25 повторностях. Для инициации соматического эмбриогенеза из зиготических зародышей использовали базовые среды DCR [24], %LV [25], Мурасиге-Скуга (MS) [26] и AI [27]. Все среды дополняли мезоинозитом - 100 мг/л (Sigma-Aldrich, США), гидролизатом казеина - 500-1000 мг/л (Sigma-Aldrich, США), L-глутамином - 500 мг/л (Sigma-Aldrich, США), сахарозой 30 г/л (ЗАО «Омскреактив», Россия) и агаром - 7 г/л (Sigma-Aldrich, США). В качестве антиоксидантов применяли аскорбиновую кислоту (АК) (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 400 мг/л. Уровень регуляторов роста составлял: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) - 2 мг/л (Sigma-Aldrich, США) и 6-бензоаминопурина (BAP) - 1 мг/л (Sigma-Aldrich, США). Для пролиферации полученной эмбриональной массы применяли базовые среды DCR и AI, содержащие 2,4-D (2 мг/л), BAP (0,5 мг/л) и сахарозу (20 г/л). Водородный показатель доводили до значения рН = 5,8. Все питательные среды и компоненты стерилизовали в зависимости от их термолабильных свойств. Культуры инкубировали в темноте при температуре 24±1 °C. Субкультивирование на свежие питательные среды проводили каждые 14 суток. Для контроля качества клеточных линий (CL) при субкультивировании проведены цитологические анализы с использованием временных препаратов. Для приготовления препаратов кусочки каллуса помещали на предметное стекло и 2-3 мин выдерживали в красителе (2%-ный водный раствор сафранина). Далее добавляли глицерин и накрывали препарат покровным стеклом. Просмотр микроскопических образцов с помощью микроскопа МИКМЕД-6 ЛОМО (Санкт-Петербург, Россия) с видеонасадкой DSM510. Объем выборки составил 3-5 препаратов на каждую CL. Качественным показателем эмбриогенности культур служило наличие в них даже единичных структур с выраженной полярностью: глобулярного зародыша с суспензором. Индукция соматического эмбриогенеза у ели сибирской 9 Результаты исследования Индукция соматического эмбриогенеза. Исследование ели сибирской в окрестностях г. Красноярска в 2014-2020 гг. показало нерегулярность урожая этого вида. В 2018 и 2020 гг. урожай шишек у ели сибирской был очень слабым - на деревьях формировались единичные мегастробилы. Проведенные эксперименты показали, что на индукцию каллусогенеза и формирование эмбриогенных культур влияет стадия развития экспланта. Введенные в культуру экспланты (зиготические зародыши) в течение июля-августа лучше всего индуцировали каллус на стадии развития семядолей (87-95 %) (табл. 1). На стадии инициации семядолей индукция эмбриогенного каллуса была низкой (10-15%). У эксплантов, введенных на стадии глобулярного зародыша (сбор материала с 8-15 июля), как извлеченных из мегагаметофитов, так и вместе с ними, у всех исследуемых генотипов ели никаких морфогенетических реакций на протяжении двух месяцев культивирования не наблюдали. У введенных в культуру зрелых зародышей (август) образование каллуса составило 40% (см. табл. 1). Таблица 1 [Table 1] Влияние стадии развития эксплантов ели сибирской на формирование эмбриогенного каллуса [Effect of the development stage of Siberian spruce explants on the formation of embryogenic callus] Стадия развития экспланта [Development stage of the explant] Сроки взятия образца [Terms of collecting explants] Частота формирования каллуса [Callus formation frequency], % Глобулярный зародыш [Globular embryo] 01-14.07 0 Стадия инициации семядолей [Cotyledon initiation stage] 15-17.07 10-15 Стадия развития семядолей [Cotyledon development stage] 21-27.07 87-95 Зрелый зародыш [Mature embryo] 17-30.08 40 Индукция каллусных культур на стадии развития семядолей проведена на четырех средах: DCR, %LV, MS и AI. Частота формирования каллуса у ели сибирской на среде DCR составила 90%, на среде %LV - 87%, AI - 82%, на среде MS частота формирования каллуса не превышала 41% (табл. 2). У значительного числа эксплантов формировался плотный каллус (рис. 1, A). У 5% эксплантов образовывался рыхлый каллус белого или желтого цвета (рис. 1, B). Плотный каллус состоял из изодиаметрических клеток (рис. 2, A, B, C), рыхлый - из удлиненных клеток (рис. 2, D), а впоследствии - из эмбрионально-суспензорной массы (ESM). Цитологический анализ показал, что каллус состоит из клеток разных типов. Первый тип клеток составили удлиненные клетки, достигающие в И.Н. Третьякова, М.Э. Пак, А.П. Пахомова и др. 10 длину 100,0 ± 3 мкм (рис. 2, D), другие - состояли из изодиаметрических клетокдиаметром 60 ± 3,5мкм (рис. 2,А-С). Рис.1. Каллуснаямасса Piceaobovata: A - плотный каллус; B - рыхлый каллус.Автор фотоА.П.Пахомова [Fig. 1. Callus Picea obovata: A - Dense callus, B - Friable callus. Photo by Angelica Pakhomova] Таблица 2 [Table 2] Индукция каллусов и эмбриогенных культур Picea obovata іпѵИго I Induction of Picea oftoveOecalliMid embryogenic cultures in vitro] ГТітѵтеір> -ная тр еда [Nutrie nt medium] Дата введения в культуру in vit [Date of introdurtion into in vitro culture] Число эксплантов введенных в культуру, шт [The number of explants introduced into the culture, pcs] Пеивиатый отклик [Primary response], % Сохранность каллусов через 6 мес. культивирования [Preservation of calli after 6 months of cultivation], % Частота формирования эмбриіогенных культур [The frequency of formation of embryogenic cultures], % DCR 25.07 250 90 32 3 /ІѴ 26.07 t50 87 32 0 MS 24-27.07 250 41 15 0 AI 17.07- 02.08 250 82 30 0,8 Активной способностью к пролиферации обладали только 3 клеточные линии (из 300), две из которых получены в 2017 г. и одна в 2019 г. В этих клеточных линиях удлиненные клетки - эмбриональные трубки делились и формировали дополнительные эмбриональные трубки и эмбриональные инициали. Шло активное формирование глобулярных соматических зародышей (рис. 3, A). Соматические зародыши увеличивались в размерах и достигали 200 ± 1 мкм. К глобуле соматического зародыша примыкал хорошо развитый, массивный суспензор, характерный для зиготических зародышей ели сибирской (рис. 3, A, B). Образовывались активно пролиферирующая ESM и эмбриональные комплексы (рис. 3, B). Число соматических зародышей на глобулярной стадии развития в 1 г свежей массы ESM составляло 50,0 ± 5 шт Индукция соматического эмбриогенезауелисибирской 11 B Рис. 2.Гистология ^хжс^ invitro Picea obovata: A,B,C - изодиаметрические клетки (x Т0д) (автор фот- М.Э. Пан- D - заепинеиные клоткм (авто. -место А.П. Пахомова). МахштеОная линеіжа ІО мсм [Fcgi2. JTisCe^c^j^K' о-Рісеа абахаіт аи-тстсгя oitic(x 200): A,B,a а I-odiametricceits (Photo by Maria Park), D - Elongated cells (Photo by Angelica Pakhomova). Scale 50 цт] Рис.3. Глобулярныесоматическиезародыши клеточныхлиний елисибирской,полученныхв2017 г. (x50): A -CL2, B -CL3. Масштабнаялинейка200мкм.АвторфотоМ.Э.Пак [Fig. 3. Globular somatic embryos (x 50) of Siberian spruce cell lines obtained in 2017: A -CL2, B -CL3.Scale200 ^m.Photo by Maria Park] Обсуждениерезультатов исследования Проведенное нами исследование показало, что на индукцию и развитие соматических зародышей ели сибирской влияют такие факторы, как стадия И.Н. Третьякова, М.Э. Пак, А.П. Пахомова и др. 12 развития экспланта, состав питательной среды (минеральная основа), генотип дерева-донора. По нашим данным введение в культуру незрелых зиго-тических зародышей P. obovata в качестве первичных эксплантов на стадии раннего эмбриогенеза (глобулярный зародыш) как с мегагаметофитами, так и извлеченными из них, оказалось неэффективным. В то же время у других видов елей, например P abies [29] и P mariana [30], индукция соматического эмбриогенеза более активно происходила именно из зиготических зародышей на этапе раннего эмбриогенеза на посткливажной стадии развития (мегагаметофиты). Введение в культуру in vitro незрелых зиготических зародышей P. obovata на стадии инициации семядолей привело к незначительному образованию каллусных культур (10-13%). Индукция каллусной массы происходила только из незрелых зиготических зародышей, инокулированных на питательные среды на стадии сформированных семядолей. Подобная морфогенная реакция отмечена у P glauca, P. engelmannii [31] и P abies [4]. Значительно снижалась индукция каллусных культур у ели сибирской при введении в культуру зрелых зиготических зародышей. В то же время у других видов елей, например P abies [9, 28, 10], P mariana [30], P. morrisonicola [32], индукция соматического эмбриогенеза шла активно из зрелых зиготи-ческих зародышей, хранившихся в течение трех лет. На качество культур ели определенное влияние оказывает и состав питательных сред. Большинство сред, используемых для P. glauca, основано на среде MS и LV с различными модификациями [9, 33-35]. Среды, как правило, отличаются по составу макроэлементов. Использование других сред, например GD [36] и LP [10], при культивировании видов ели также не оказало значительного влияния на индукцию каллусных культур. В наших опытах с P obovata мы использовали четыре базовые среды - MS, DCR, %LV и AI. Оказалось, что только богатая нитратами среда MS значительно снижала выход каллусных культур у ели сибирской. При образовании каллусных культур, в том числе и эмбриогенных, мы использовали в работе классическую схему содержания ауксинов и цитокининов, используемую разными экспериментаторами - 2,4-D (2 мг/л) и BAP (1 мг/л). Успешность соматического эмбриогенеза ели сибирской, а также качество полученных соматических зародышей во многом зависели от генотипа растения-донора. В литературе отмечено, что индукция и пролиферация ESM у хвойных в культуре in vitro происходят с ограниченного числа деревьев [37-39, 14]. Известно, что соматический эмбриогенез идет под строгим генетическим контролем, так как только отдельные деревья-доноры способны формировать ESM и соматические зародыши в культуре in vitro [40, 41]. По данным Stasolla, Yeung [6], способностью к образованию ESM могут обладать 22% деревьев. В наших исследованиях с елью сибирской экспланты только двух деревьев-доноров (из 30 опытных) образовывали эмбриогенные культуры. Индукция соматического эмбриогенеза у ели сибирской 13 Заключение Таким образом, проведена комплексная оценка факторов, влияющих на индукцию соматического эмбриогенеза у ели сибирской. Полученные результаты свидетельствуют, что для успешного формирования соматических зародышей определяющим фактором является не только выбор донорных растений, но и стадия развития экспланта. Установлено, что лучшей стадией развития зиготических зародышей при введении в культуру in vitro у ели сибирской является этап незрелых зародышей со сформированными семядолями, при этом оптимальными питательными средами являются DCR, %LV и AI.

Скачать электронную версию публикации