Comparative evaluation of the effect of resveratrol and carnitine on the full transcriptomic profile of liver tissue in .pdf Сокращения [Abbreviations]: БАД - биологически активная добавка [BAFS -Biologically active food supplement]; БАВ - биологически активное вещество [BAS -Biologically active substance]; l-Кар - l-карнитин [l-Car - l-carnitine]; Рес - ресвератрол [Res - Resveratrol]; DBA/2J - мыши линии DBA/2J [Line of mice DBA/2J]; DBCB - мыши-тетрагибриды [Tetrahybrid mice]; ВУВЖР - высокоуглеводный, высокожировой рацион [HFCD - High-carbohydrate and high-fat diet]; ДЭ - дифференциальная экспрессия [DE - Differential expression]. Для цитирования: Трусов Н.В., Апрятин С.А., Тимонин А.Н., Шипелин В.А., Гмошинский И.В., Никитюк Д.Б. Сравнительная оценка влияния ресвератрола и карнитина на полнотранскриптомный профиль ткани печени мышей с различной предрасположенностью к развитию алиментарного ожирения // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2021. № 54. С. 83-115. doi: 10.17223/19988591/54/5 Н.В. Трусов, С.А. Апрятин, А.Н. Тимонин и др. 84 Введение В лечении ожирения и родственных алиментарно-зависимых заболеваний (атеросклероза, сахарного диабета 2-го типа, метаболического синдрома, артериальной гипертонии и др.) наряду с использованием традиционных диет, основанных на редукции общей калорийности, ограничении простых углеводов, животных жиров и холестерина в качестве полезного дополнения рассматриваются специализированные продукты и биологически активные добавки (БАД) к пище, обогащенные минорными биологически активными веществами (БАВ). Имеющаяся у них способность при поступлении в организм в дозах, близких к их содержанию в естественном пищевом рационе, нормализовать нарушенные процессы липидного и углеводно-энергетического обмена, корректировать пищевое поведение, стимулировать физическую активность больных, регулировать состав кишечного микробиоценоза позволяет, по современным данным, значительно повысить эффективность диетотерапии и закрепить ее результаты [1-3]. В качестве основных групп БАВ, потенциальных модуляторов жирового и углеводно-энергетического обмена, рассматриваются полифенольные соединения (флавоноиды, ресве-ратрол и др.) [4, 5], фитостерины, аминокислоты [6], витаминоподобные вещества (l-карнитин, коэнзим Q10, липоевая кислота и др.) [7-9]. Персонифицированное назначение продуктов, обогащенных перечисленными БАВ, требует учета природы и механизмов их воздействия на обменные процессы с учетом генотипа больного, тяжести, стадии патологического процесса. Механистические представления о потенцирующем либо ингибирующем влиянии БАВ на отдельные звенья метаболизма и ферментные системы в настоящее время сменяются концепцией комплексного воздействия на одновременную экспрессию большого числа генов. Понимание этих процессов позволяет не только более адресно назначать диетотерапию больным, но и понимать причины неоднозначности результатов клинического применения ряда БАВ в диетическом и специализированном питании [10, 11], что вызывает сомнения в целесообразности их использования с позиций современной доказательной медицины. Одним из мощных методов изучения экспрессии генов является полно-транскриптомный анализ на микрочипе, впервые использованный для оценки влияния различных диетических факторов в 2000 г. [12]. Данный подход позволяет, с привлечением методов биоинформатики, не только одновременно получить данные о транскрипционной активности практически полного комплекса генов, представленных в ткани или клетке, но и сделать содержательные выводы об изменениях в метаболических путях, находящих отражение на фенотипическом уровне. Целью настоящего исследования явился анализ нутригеномных механизмов воздействия биологически активных веществ - l-карнитина (1-Кар) и ресвератрола (Рес) на организм мышей линии DBA/2J и тетрагибридов DBCB, отличающихся по генотипу и чувствительности к развитию индуци- Сравнительная оценка влияния ресвератрола и карнитина 85 рованного рационом ожирения, с использованием метода полнотранскриптомного профилирования ткани печени. Материалы и методики исследования Эксперимент проведен на самцах мышей (возрастом 8-10 недель) линии DBA/2J и гибридов 2-го поколения DBCB, полученных посредством скрещивания четырех линий мышей (DBA/2J, BALB/c, CBA/lac и C57Black/6J), поступивших из питомника «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России» (Московская обл., Россия). Для получения F1 самки DBA/2J скрещены с самцами BALB/c (1-й гибрид F1), а самки CBA/lac с самцами C57Black/6J (2-й гибрид F1). Для получения тетрагибридов мыши из обоих гибридов первого поколения скрещены между собой. Работа с животными выполнена в соответствии с международными рекомендациями (Directive 2010/63/EU on the protection of animals used for scientific purposes adopted on September 22, 2010; Guide for the care and use of laboratory animals. Eighth Edition / Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals; Institute for Laboratory Animal Research (ILAR); Division on Earth and Life Studies (DELS); National Research Council of the national academies. Washington: The National Academies Press. 2011). Дизайн эксперимента одобрен Комитетом по этике ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (протокол № 4 от 20.04.2017 г.). Мыши (как линейные, так и тетрагибриды) в эксперименте разделены на 4 группы равной численностью по 8 особей. Средняя масса тела в сформированных группах изначально статистически значимо не различалась у животных каждого генотипа (р > 0,1 ; ANOVA). В течение 65 суток животные 1-х (контрольных) групп получали сбалансированный полусинтетический рацион по AIN93M с некоторыми модификациями [13] и очищенную обратным осмосом питьевую воду, животные 2-х групп -высокоуглеводный, высокожировой рацион c повышенным содержанием жира (30% по массе сухих веществ рациона) и с заменой питьевой воды на 20% раствор фруктозы (ВУВЖР), животные 3-х групп - такой же рацион с добавлением Рес (DSM, Голландия, торговая марка resVida®, 98% чистоты по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии) в расчётной дозе 25 мг/кг массы тела (м.т.), 4-х групп - такой же рацион с добавлением l-Кар (WIRUD, Германия, 98% чистоты по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии) в расчётной дозе 300 мг/кг массы тела (м.т.). Мышей содержали по 4 особи в клетке при температуре 21±1 оС и режиме освещения 12/12 ч. Количество съеденного корма и выпитой жидкости определяли ежедневно, массу тела - 1 раз в 3 суток с точностью ±0,1 г путем взвешивания на электронных весах, наблюдали за внешним видом, активностью, состоянием шерстяного покрова, особенностями поведения. Н.В. Трусов, С.А. Апрятин, А.Н. Тимонин и др. 86 Выведение животных из эксперимента осуществляли на 66-е сутки путем обескровливания из нижней полой вены под эфирной анестезией. Массу органов, забрюшинной и бурой подлопаточной жировой ткани определяли на лабораторных весах с точностью ±0,01 г. Кровь собирали в пробирки с антикоагулянтом 1,0% раствором гепарина в 0,15 М NaCl (1:10 по объему), плазму отделяли центрифугированием в течение 30 минут при 3 000 об/мин и проводили исследование биохимических показателей (содержание глюкозы, триглицеридов, холестерина и др.) на биохимическом анализаторе Konelab 20i (Thermo Clinical Labsystems Oy, Финляндия) по стандартным методикам. Печень отбирали в асептических условиях стерильными хирургическими инструментами, немедленно охлаждали до 0 °С и делили на две порции. Первый образец фиксировали в 10% нейтральном формалине для морфологического исследования, а второй охлаждали до -80 °С и хранили до проведения полнотранскриптомного анализа. Морфологическое исследование ткани печени проводили с использованием световой микроскопии после окрашивания парафиновых срезов тканей гематоксилин-эозином по ранее описанной методике [14]. Полнотранскриптомный анализ выполнен с помощью набора Gene Expression Hybridization Kit (Agilent Technologies, США). Методика выделения тотальной РНК и полнотранскриптомного профилирования ткани печени детально изложена в работе [15]. В работе использованы микрочипы SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray Kit (Agilent Technologies, США, каталожный номер G4852A). На 4 микрочипах 32 независимых образца РНК печени из всех 8 групп мышей (по 4 образца из группы). Сканирование проведено с помощью Sure Scan Microarray Scaner (Agilent Technologies, США). Дифференциальная экспрессия (ДЭ) генов выражена в виде логарифма по основанию 2 возрастания или убывания флуоресценции (log2FC) по сравнению с группами, рассматриваемыми в качестве контроля, по отдельности для мышей DBA/2J и DBCB в следующих сравнениях: 1) между животными, получавшими ВУВЖР, и животными контрольной группы; 2) между мышами, получавшими оба типа добавок (Рес и l-Кар), и мышами, получавшими ВУВЖР. После этого выявленные для всех этих сравнений профили ДЭ сравнены между мышами DBA/2J и DBCB с помощью теоретико-множественного анализа (метод диаграмм Венна). Данные сканирования чипов и расчета величин ДЭ в виде электронных таблиц экспортированы в среду «R» и проведён биоинформатический анализ с квантильной нормализацией и дальнейшим анализом ДЭ в пакете limma. Для выявления метаболических путей среди представленных в международной базе данных генов, метаболических путей и функций биологических систем Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (https://www. genome.jp/kegg/) и их визуализации применены пакеты AnnotationDbi, org. Rn.eg.db, pathview, gage, gageData. Визуализация результатов на всех этапах с помощью стандартной графики «R» и дополнительные пакеты ggplot2, Сравнительная оценка влияния ресвератрола и карнитина 87 ggrepel и gplots. Статистическая значимость изменения экспрессии оценена путём анализа логарифмов интенсивности флуоресценции, нормализованных по внутреннему контролю (Spike-In) с использованием Т-теста с множественной коррекцией Benjamini-Hochberg [16]. Корреляционный анализ ДЭ генов выполнен с использованием z-трансформации Фишера полученных корреляций Пирсона, а также оценки линеаризованности кривой связи между анализируемыми генами при проверке нуль гипотезы r=0 для оценки ненулевой корреляции и r=1 для оценки хорошо линеаризованной кривой связи при уровне значимости 0,05. Поиск информации о биологических функциях генов осуществлен с использованием ресурса GeneMANIA (http:// genemania.org/), интегрированного с Национальным центром биотехнологической информации США NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Результаты исследования и обсуждение Интегральные, биохимические и морфологические показатели животных. Данные об изменениях в интегральных и биохимических показателях мышей под действием потребления ВУВЖР представлены в предыдущей работе [17]: для мышей DBCB, получавших ВУВЖР, характерно появление фенотипических признаков ожирения, проявлявшихся в увеличении запасов абдоминального белого жира, снижении отношения массы подлопаточного бурого жира к массе белого забрюшинного жира. У мышей DBA/2J, по данным изучения интегральных показателей, фенотип ожирения при потреблении ВУВЖР не развился. В отличие от мышей DBA/2J, мыши DBCB характеризовались гипергликемией, повышенным уровнем общего холестерина и холестерина ЛПВП, являющегося его основной транспортной формой у грызунов. При морфологическом исследовании печени обнаружено, что у мышей DBA/2J, получавших контрольный рацион, отмечена нормальная структура ткани печени (рис. 1, а), а у получавших ВУВЖР отмечалось слабо выраженное диффузное накопление жира в гепатоцитах без изменения общего строения ткани. Добавки l-Кар и Рес не оказали видимого влияния на распределение жира в печени у этих животных. У мышей DBCB уже при потреблении контрольного рациона отмечалось выраженное накопление жира в клетках (рис. 1, b), а при потреблении ВУВЖР наблюдалась жировая дистрофия ткани с образованием большого числа крупных липидных вакуолей (рис. 1, c). Этот результат качественно совпал с ранее полученными данными для этих тетрагибридных мышей, получавших высокосахарозный рацион [18]. Добавка l-Кар к ВУВЖР у мышей DBCB способствовала уменьшению размера и числа жировых вакуолей и их концентрированию в периваскулярной области (рис. 1, d), а применение добавки Рес сопровождалось их практически полным исчезновением с сохранением диффузного накопления жира в гепа-тоцитах, сходного с контролем (рис. 1, e). 88 Н.В. Трусов, С.А. Апрятин, А.Н. Тимонин и др. (a) (b) (c) (d) Рис. 1. Светооптические микрофотографии срезов печени мышей. Окраска гематоксилин-эозином, увеличение *200: a - мыши DBA/2J, контрольная группа; b - мыши DBCB, контрольная группа; c - мыши DBCB, ВУВЖР; d - мыши DBCB, ВУВЖР с добавкой l-Кар; e - DBCB, ВУВЖР с добавкой Рес [Fig. 1. Light-optical micrographs of the sections of the liver of mice. Hematoxylin-eosin staining, *200 magnification: a - DBA/2J mice, control group; b - DBCB mice, control group; c - DBCB mice, HFCD; d - DBCB mice, HFCD with the addition of l-Car; e - DBCB mice, HFCD with the addition of Res] Сравнительная оценка влияния ресвератрола и карнитина 89 Потребление добавки l-Кар вместе с ВУВЖР привело у мышей DBCB к статистически значимому снижению уровней триглицеридов плазмы крови, снижению активности в плазме аланиновой (АЛТ) и аспарагиновой (АСТ) трансаминаз без изменения их соотношения. Сходное действие на биохимические показатели у этих животных оказала и добавка Рес. Эффектов обеих добавок к ВУВЖР в отношении биохимических показателей у мышей DBA/2J не выявлено [18]. Полнотранскриптомное исследование генов печени. Представленные на ДНК-микрочипе нуклеотидные последовательности покрывают 39430 генов, в числе которых кодирующие последовательности генов, а также длинные межгенные некодирующие РНК (long intergenic noncoding RNAs, lincRNAs) генома Mus domesticus согласно [19]. ДЭ как минимум для одного из межгрупповых сравнений в размере |log2FC|>0,5 (в сторону как усиления, так и ослабления) и при уровне значимостиp-value < 0,05 выявлена для 415 транскриптов (1,1% от общего числа представленных на чипе). Из них для 100 генов (0,25%) ДЭ выявлена при двух, для 28 (0,07%) - при трех, для 3 (0,01%) - при 4 межгрупповых сравнениях. С использованием аннотированной международной базы данных GeneMANIA представлены сведения о 311 транскриптах, отождествляемых с белками или РНК с известной функцией. Перечни кратких международных наименований генов, ответивших на примененные диетические воздействия у мышей двух генотипов, и аннотируемых в используемой базе данных, приведены в табл. 1-3. Таблица 1 [Table 1] Список кратких международных обозначений генов1 с ДЭ в печени в ответ на потребление ВУВЖР (в сравнении с животными контрольной группы) [List of short international designations of genes with DE in the liver in response to the consumption of HFCD (in comparison with the animals of the control group)] Интервал ДЭ [DE interval] (log2FC) Только у мышей DBA/2J [DBA mice only] Только у мышей DBCB [DBCB mice only] У мышей обоих генотипов2 [Both mice genotypes] Положительная ДЭ [Positive DE] >1,0 Chacl Vps16, Ifi202b, Vnn1, Pcp4l1, Cox6b2, Lgals1 Mt1, Aatk 0,5-1,0 Fam25c, Pim3, Mvd, Maff, S100a9, Upp2, Mafb, Tef Hsd17b7, Etfbkmt, Slc5a6, Plekhfl, Ccnel, Cyp2d40, Herpudl, Klhl21, Csrnpl, Golph3l, Klf9, Hist1h2ao, Saa4 Sult2a7, Fam213b, Rs5-8s1, Acnat2, Gypc, Nat8, Gck, Itpa, Sipa1l2, Gpc1, Samd9l, Haus8, Doplb, Bmp7, N4bp2,Ifit3, Lrg1, Wnt5b, Slc22a7, Retsat, Acaa1b, Aspa, Qpct, Crot, Tmem98, Smim10l1, Paqr7, Rtn4rl1 Msmo1, Raet1e, NrldP, Pparg, Idil, Mvk 90 Н.В. Трусов, С.А. Апрятин, А.Н. Тимонин и др. Окончание табл. 1 [Table 1 (end)] Интервал ДЭ [DE interval] (log'FC) Только у мышей DBA/2J [DBA mice only] Только у мышей DBCB [DBCB mice only] У мышей обоих генотипов2 [Both mice genotypes] Отрицательная ДЭ [Negative DE] (-1,0)-(-0,5) Tubb5, Tmie, Gstm2, Dhx58, Oasl2, Prg4, Irf7, Cyp2c68, Tuba1c, Lrfn3, Sdf2l1, Chka,Dido1, Oaslf Gstm4, Ang, Cd52, Gsta2, F2r, Mgat2, Pltp, Neurl2, Apom, Rbm3, Ang3, Acly, Ccl5, Tfg, Nkd2, Ang4, Jun, G6pdx, Dntt, Sucnrl, Ang2, Cd74, Lrtm1, Klf10, Cdh1, Psen2, H2-Eb1, Pop4 Slc35g1, Dusp6, Cyp2c70, Isg153 1,0 G6pc3 Marco, Psen23, Igfbpl - 0,5-1,0 Etnppl, Tkfc4, Pklr4, Ppan, DidoP, Ddit4, Inhbe, Celsr13 Cyp2c233, NrldP, Ddc, LrtmP, Dusp23, Dnajbll, Hs3st6, Trib3, Eno3, CdhP, Fastk, Cox7a1, Adam11, Abhd14b, Dusp6i, Slc15a4, Ocell, Cygb, Rnf39, Fgfrl1, Brap, Stab2, Col6a1, Sparcll, Gm13021, Cnp, Fcna, Rbm33, Slc2a5, Slc5a6, Btbd9, Susd4, Ang33 - Отрицательная ДЭ [Negative DE] (-1,0) -(-0,5) Goltla, CsrnpP, Ccl6, Klf10, Maff Bpifc, Tmem33, Gls2, Camk2n1, Hspa5, Hikeshi, Phflld, Cript, Odc1, Tubalc, Chchd4, Slc39a4, Smim10lP, Ppp1r3b, Manf,Chordc1,Dcaf12l1,Zfp 672,Stip1,Ifi47, Cacybp, Steap4, Sdf2l1, Irgml, Timd2, Psme3, Them7, Rs5-8sP, Rdh16f2, Guk1, Klhl25, Hist1h2ab, Zfp133-ps, Samd9P, Fryl, Rtp4, Gsta4, Ces2b, Hbb-bl, Crot3, Tmem14a, Etfbkmt, Pinx1, Slc1a4, LgalsP. Arhgef15, Zbpl Сравнительная оценка влияния ресвератрола и карнитина 91 Окончание табл. 2 [Table 2 (end)] Интервал ДЭ [DE interval] (log2FC) Только у мышей DBA/2J [DBA mice only] Только у мышей DBCB [DBCB mice only] У мышей обоих генотипов2 [Both mice genotypes] Isg153,Tuft1, Scn8a, Mal2, Cysl, HausS3, Slc10a2, Gm9706, Pnma2, Ly6c1, Gstm2, Histlh2ba, Gpcl3, Trpml, Raetle3, Fam25c, Gck3, Aars2, Hsphl 1,0 g 0,5-1,0 Pomk, Clec4g Отрицательная ДЭ (-1,0)- (-0,5) Slc13a3, Prg43, Mvk3, Luc7l3, Eif3j2 Tff33, PopP, CrybbP3, Cdhl35, _Dnaibll5, Dnaicl, Krt222,_ Snap23, Cyp2c233-5, Oprml, Tacr2, Fgf23, Dclk3, TribP5, Zfp663, Sipall23, Nab2, Fbxo2l, Cib33, Psen235, Cyp2d37-ps, Cspg5, Vwce, Col6al5, FgfrlP, Tent5c, Gstp3, H2-Q5, Rbpl, Slcl7a5, Plekhg6, Slc2a55, Podn, Rasgeflb, Cygb5, Zbtb20, Scampl, Fll, Tbcld2b, Ccnel, Sytl, Isynal, Spsb4, Igsf8, Sptbn2, Pcp4lP, Susd45, Adcy9, _Slc5a65, Pura, Sultlc2, Tnxb_ Serpinhl, Ykt6, Tuba1c5, Creb5, Hacll, Dhrs4, Vnn3, Grhpr, Manf5, Cdadcl, Suox, Saraf Ccl6, Hmgn5, Slc10a25, Hikeshi5, Hspb8, Pdia4, Hspa55, Hist1h2bm, Serpina3h, Suv39h2, Irgm15, Skint7, Serpina3n, BmpP, Chordcl5, Cops9, Tmie, Sult2a73, Mms22l, Ifi27, Rtn4, Mx2, Pak4, Ppal, Atp6v0e2, Lbp, Spc25, Srekl, Hpgd, Nelfcd, Retsat3, OdcP, Zfp6725, Cyp3al6, Fam2l3b3, Cyp3all, Hbb-b25, Goltla, Cacybp5, Atxn7, Capzal, Pklr4, Hbb-b15, Hbb-bt, Hba-a1, Tkfc4 Н.В. Трусов, С.А. Апрятин, А.Н. Тимонин и др. Окончание табл. 3 [Table 3 (end)] Интервал ДЭ [DE interval] (log2FC) Только у мышей DBA/2J [DBA mice only] Только у мышей DBCB [DBCB mice only] У мышей обоих генотипов2 [Both mice genotypes] Hemgn, Fitm1, Ung, Mcam, Ephb3, Eyal, Steap45, ZbpP, Hist1h2ba5, GukP, Etfbkmt5, Ralgps1, Gsta23, Mtfr2, Ifi202b3-5, Serpinb8, Gck3-5, Ldlrad3, Isg153 5, Synj2, Sdf2l15, Tmem239, Vnn13 0,1) гена Maff (кофактор Nrf2-опосредуемой активации антиоксидант-чувствительных элементов генома) [39], S100a9, известного также как MRP14 - миелоид-родственный белок, играющий роль в реакциях врожденного иммунитета [40], и Klf9 - фактора дифференцировки адипоцитов, регулируемого PPARy [41]. Отрицательная ДЭ отмечена для гена Prg4 (протеогликан 4), возможно, отвечающего за накопление избытка жира, дислипидемию и инсулиновую резистентность [42], Didol (транскрипционный фактор, участвующий в процессах апоптоза) и Igfbpl (белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 1), участвует в развитии гипергликемии на высокоуглеводных рационах и является биомаркером метаболического синдрома [43]. Следует отметить, что в нашем предыдущем исследовании [44] Igfbpl ответил противоположной по направленности ДЭ в ответ на потребление флавоноида кверцетина у генетически тучных мышей db/db и мышей линии C57B1/6J, получавших ВУВЖР. Переходя к обсуждению эффектов влияния Рес и l-Кар на полнотранскрип-томный профиль ткани печени, следует в первую очередь остановиться на генах, ответивших противоположной по знаку статистически значимой ДЭ на ВУВЖР, с одной стороны, и на оба типа добавок - с другой. У мышей тетрагибридов DBCB показана ДЭ для генов Psen2, Lgals1 и Cdh1. Для Psen2 (presenilin 2), подавляемого на ВУВЖР и активируемого при потреблении обеих добавок, показано наличие выраженного противовоспалительного действия [45]. Данный белок представляет собой одну из субъединиц мембранной связанной протеазы (у-секретаза), отвечающей за элиминацию дефектных клеточных белков. В ЦНС он, по-видимому, играет важную роль в защите от развития болезни Альцгеймера; значение его экспрессии в периферических органах, включая печень, мало изучено. Такой же направленностью ДЭ характеризовался Cdh1. Он кодирует cadherin-1, известный также как LCAM, принадлежащий к семейству каль-ций-зависимых трансмембранных белков клеточной адгезии, играющих важную роль в пролиферации и дифференцировке к

Скачать электронную версию публикации