The effect of cadaverine on redox homeostasis of wheat seedling roots and their resistance to damage heating.pdf Сокращения [Abbreviations]: DMTU - диметилтиомочевина [Dimethylthiourea]; ROS - активные формы кислорода [Reactive oxygen species]; SOD -супероксиддисмутаза [Superoxide dismutase]; LPO - перекисное окисление липидов [Lipid peroxidation]. Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней 117 Для цитирования: Кокорев А.И., Колупаев Ю.Е., Шкляревский М.А., Луговая А.А. Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней проростков пшеницы и их устойчивость к повреждающему нагреву // Вестник Томского государственного университетата. Биология. 2021. №. 54. С. 116-137. doi: 10.17223/19988591/54/6 Введение Полиамины - метаболиты растений, задействованные во многих процессах в физиологически нормальных и особенно стрессовых условиях [1, 2]. Предполагается, что при действии на растения неблагоприятных факторов они могут способствовать поддержанию структуры биомакромолекул и мембран, а также участвовать в клеточном сигналинге [2, 3]. Имеются данные о повышении устойчивости растений к абиотическим стресс-факторам различной природы под влиянием экзогенных полиаминов [4-6]. Диамин кадаверин - малоизученный растительный полиамин [7]. Он образуется из лизина путем пиридоксальфосфат-зависимого декарбокси-лирования, катализируемого лизиндекарбоксилазой [8]. Кадаверин обнаружен в различных органах растений разных таксономических групп [7]. Однако его абсолютное содержание у растений обычно ниже по сравнению с количеством других полиаминов [9]. Показано повышение содержания кадаверина в листьях растений фасоли [10] и корнях хрустальной травки (Mesembryanthemum crystallinum L.) [11] при действии высоких температур. В органах хрустальной травки также зарегистрировано накопление кадаверина при продолжительном действии солевого стресса [12]. Данные о влиянии экзогенного кадаверина на устойчивость растений к стрессорам и функционирование их протекторных систем очень малочисленны. Обнаружено усиление прорастания семян редиса при 38 °С в присутствии 10 мкМ кадаверина [13]. Показано, что в присутствии NaCl и соли свинца под влиянием 1 мМ кадаверина усиливался рост проростков рапса, увеличивалось содержание в них каротиноидов и повышалась активность нитратредуктазы [14]. Связь физиологических эффектов кадаверина с образованием сигнальных посредников, в частности активных форм кислорода (ROS), остается малоизученной. Обнаружено, что экспозиция корневой системы хрустальной травки в среде с добавлением кадаверина индуцировала интенсивную экспрессию гена, кодирующего цитоплазматическую изоформу супероксид-дисмутазы (Cu/Zn-SOD). Этот эффект не устранялся действием ингибитора диаминоксидазы аминогуанидина, что дало основание авторам предполагать возможность прямого (без участия сигнальных посредников) влияния кадаверина на экспрессию отдельных генов SOD [15]. Однако специальных исследований роли ROS в проявлении влияния кадаверина на стрессоустойчивость растений до сих пор не проводилось. Цель работы - изучение возможного протекторного влияния кадаверина на проростки пшеницы при тепловом стрессе и его связи с образованием и обезвреживанием ROS. А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 118 Материалы и методики исследования В работе использованы этиолированные проростки мягкой озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Досконала. Семена репродукции 2019 г. любезно предоставлены сотрудниками Института растениеводства им. В.Я. Юрьева НААН Украины (г. Харьков, Украина). Зерновки, поверхностно обеззараженные в 6%-ном растворе пероксида водорода, проращивали при температуре 20-22 °С на водопроводной воде, очищенной с использованием системы водоподготовки, включающей в себя фильтр механической очистки, угольный фильтр и полупроницаемую обратноосмотическую мембрану с размером ячеек 1 нм. На третьи сутки проращивания в среду добавляли кадаверин в диапазоне концентраций от 0,05 до 2,5 мМ и выдерживали проростки на его растворе в течение одних суток, проростки контрольного варианта продолжали инкубировать на очищенной водопроводной воде. В отдельных вариантах опыта проростки в течение 26 ч обрабатывали скавенджером пероксида водорода диметилтиомочевиной (DMTU) -150 мкМ) [16], ингибитором диаминоксидазы аминогунидином (1 мМ) [17] или ингибитором НАДФН-оксидазы имидазолом (10 мкМ) [18]. В вариантах по изучению комбинированного действия кадаверина, DMTU и ингибиторов диаминоксидазы и НАДФН-оксидазы последние вносили в среду инкубации проростков за 2 ч до начала 24-часового воздействия кадаверина. Таким образом, общее время инкубации проростков в присутствии DMTU, аминогуанидина и имидазола в этих вариантах составляло также 26 ч. Концентрации указанных соединений, существенно модифицирующие эффекты экзогенного кадаверина, но не вызывающие визуально видимых токсических эффектов, выбирали в предварительных опытах. Для биохимических анализов использовали корни проростков, поскольку они более чувствительны к воздействиям экзогенных соединений и гипертермии [19]. Содержание пероксида водорода определяли с помощью ферротиоцианатного метода, экстрагируя пероксид водорода из растительного материала на льду 5% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) [20]. Содержание H2O2 выражали в нмоль/г сырой массы. Для анализа количества продуктов перекисного окисления липидов (LPO), реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, корни гомогенизировали в реакционной среде, содержащей 0,25%-ную 2-тиобарбитуровую кислоту в 10%-ной ТХУ, гомогенат помещали в кипящую баню на 30 мин. Затем пробы охлаждали и центрифугировали 15 мин при 10000 g на центрифуге MPW 350R («MPW Medlnstruments», Польша). Оптическую плотность надосадочной жидкости определяли на спектрофотометре СФ-46 («ЛОМО», Россия) при 532 нм (максимум светопоглощения малонового диальдегида) и 600 нм (для поправки на неспецифическое светопоглощение) [21]. Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней 119 При определении активности антиоксидантных ферментов - SOD, каталазы и гваяколпероксидазы - навески корней гомогенизировали на холоде в 0,15 М K, Na-фосфатном буфере (pH 7,6), содержавшем ЭДТА (0,1 мМ) и дитиотрейтол (1 мМ) [22]. Гомогенат сразу использовали для анализа. Активность ферментов определяли в супернатанте после центрифугирования гомогената при 8000 g в течение 10 мин при 4 °С. Содержание воды в корнях проростков разных вариантов в период отбора проб для биохимических анализов существенно не изменялось, в связи с этим изучаемые показатели рассчитывали на грамм сырой массы. Активность SOD (КФ 1.15.1.1) определяли при pH 7,6 [23], используя метод, основанный на способности фермента конкурировать с нитросиним тетразоли-ем за супероксидные анионы, образующиеся вследствие аэробного взаимодействия НАДН и феназинметосульфата; оптическую плотность определяли при 540 нм. Активность SOD выражали в усл. ед./(г сырой массы х мин). Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) анализировали при рН 7,0 [23] по количеству пероксида водорода, разложившегося за единицу времени, и выражали в ммоль Н202/(г сырой массы х мин). Активность гваяколпероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли с использованием гваякола в качестве донора водорода и пероксида водорода в качестве субстрата. Предварительно рН реакционной смеси доводили до 6,2 с помощью К,№-фосфатного буфера [23]. Оптическую плотность тетрагваякола определяли при 470 нм. Активность фермента выражали в ммоль тетрагвая-кола/(г сырой массы х мин). Для определения теплоустойчивости проростков их подвергали повреждающему нагреву в водяном ультратермостате при температуре 45,0 ± 0,1 °С в течение 10 мин. После этого проростки всех вариантов переносили на очищенную водопроводную воду. Через 3 суток (после четкой визуализации повреждений) оценивали относительное количество выживших проростков. К живым относили проростки, не имевшие существенных некрозов и сохранившие способность к росту [19]. Эксперименты проведены в 5-кратной биологической повторности. На рисунках приведены средние величины и их стандартные ошибки (M±mM). Статистическую значимость различий определяли с использованием ^-критерия Стьюдента. Кроме специально оговоренных случаев, обсуждаются эффекты, значимые при р < 0,05. Результаты исследования В первой серии экспериментов изучена концентрационная зависимость влияния кадаверина на теплоустойчивость проростков пшеницы. Инкубация в присутствии кадаверина повышала устойчивость проростков к повреждающему нагреву (рис. 1). Значимый защитный эффект наблюдали при его действии в концентрациях диапазона 0,5-2,5 мМ. Наибольшее относи- А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 120 тельное количество выживших проростков отмечено в варианте с обработкой 1 мМ кадаверином. Именно в этой концентрации кадаверин использовали для изучения возможной связи между изменениями редокс-гомеостаза и проявлением его стресс-протекторного действия. Рис. 1. Концентрационная зависимость влияния кадаверина на выживание (%) проростков пшеницы через 3 суток после 10-минутного прогрева при 45 °С (M±mM). Разными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми статистически значимы (р < 0,05) [Fig. 1. Concentration dependence of cadaverine effect on wheat seedling survival (%) 3 days after damaging heating (10 min at 45 °C) (M±mM). Different Latin letters denote values, the differences between which are statistically significant (p < 0.05)] Обработка кадаверином вызывала повышение содержания пероксида водорода в корнях (рис. 2). Заметный эффект наблюдался через 1-4 ч после ее начала с максимумом через 2 ч. Увеличение содержания пероксида водорода носило транзиторный характер и через 24 ч инкубации отмечалось даже некоторое снижение количества H2O2 в корнях опытного варианта. Предварительная обработка проростков скаведжером пероксида водорода DMTU снимала проявление эффекта повышения содержания H2O2 в корнях, вызываемое 2-часовым воздействием кадаверина (рис. 3). Этот эффект также полностью устранялся действием ингибитора диаминокси-дазы аминогуанидином и почти не изменялся в присутствии ингибитора НАДФН-оксидазы имидазола. Таким образом, данные ингибиторного анализа указывают на зависимость вызываемого кадаверином эффекта повышения содержания пероксида водорода в клетках корней в первую очередь от активности диаминоксидазы. 121 Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней придействиикадаверина (M±mM): 1 - контроль; 2 - кадаверин. Разнымилатинскими буквами обозначены величины, различия между которыми статистически значимы (p < 0,05) [Fig.2. Dynamicsof thehydrogenperoxidecontentinroots ofwheat seedlings under the action of cadaverine (M±mM): 1 - Control; 2 - Cadaverine (1 mM). DifferentLatinlettersdenote values,thedifferencesbetweenwhicharestatistically significant(p < 0.05)] Для выяснения значения ROS в индуцировании кадаверином теплоустойчивости проростков оценивали влияние DMTU, аминогуанидина и имидазола на проявление его протекторных эффектов. Через сутки после повреждающего прогрева в корнях проростков отмечалось повышение содержания продуктов LPO (рис. 4, а). Обработка кадаверином заметно уменьшала проявление окислительного стресса. DMTU слабо влияла на содержание продуктов LPO в корнях, но при этом в значительной степени нивелировала защитный эффект кадаверина. При обработке аминогуанидином содержание продуктов LPO в корнях проростков почти не изменялось, но этот ингибитор диаминоксидазы снимал вызываемый действием кадаверина эффект уменьшения их накопления после теплового стресса. В корнях проростков, обработанных ингибитором НАДФ^оксидазы имидазолом, содержание продуктов LPO не изменялось, не влиял имидазол и на проявление эффекта кадаверина на их содержание в корнях. Данные по влиянию исследуемых соединений на выживание проростков после повреждающего нагрева согласуются с их эффектами на показатель окислительного стресса. Сами по себе DMTU, аминогуанидин и имидазол не оказывали влияния на выживание проростков после теплового стресса (рис. 4, b). При этом DMTU и аминогуанидин полностью устраняли защитный эффект кадаверина. В присутствии имидазола стресс-протекторное действие диамина немного снизилось. А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 122 180 1 2 3 4 5 6 7 8 Рис. 3. Содержание пероксида водорода в корнях проростков пшеницы при действии кадаверина, DMTU, аминогуанидина и имидазола (M±mM). 1 - контроль; 2 - кадаверин (1 мМ); 3 - DMTU (150 мкМ); 4 - кадаверин (1 мМ) + DMTU (150 мкМ); 5 - аминогуанидин (1 мМ); 6 - кадаверин (1 мМ) + аминогуанидин (1 мМ); 7 - имидазол (10 мкМ); 8 - кадаверин (1 мМ) + имидазол (10 мкМ). Обработку корней кадаверином проводили в течение 2 ч, DMTU и ингибиторы ферментов добавляли в среду инкубации корней за 2 ч до внесения кадаверина. Разными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми статистически значимы (р < 0,05) [Fig. 3. Hydrogen peroxide content in roots of wheat seedlings under the action of cadaverine, DMTU, aminoguanidine and imidazole (M±mM). 1 - Control; 2 - Cadaverine (1 mM); 3 - DMTU (150 цМ); 4 - Cadaverine (1 mM) + DMTU (150 цМ); 5 - Aminoguanidine (1 mM); 6 - Cadaverine (1 mM) + Aminoguanidine (1 mM); 7 - Imidazole (10 ^M); 8 - Cadaverine (1 mM) + Imidazole (10 ^M). The roots were treated with cadaverine for 2 h; DMTU and enzyme inhibitors were added to the incubation medium of roots 2 h before adding cadaverine. Different Latin letters denote values, the differences between which are statistically significant (p < 0.05)] Уменьшение проявления окислительного стресса (накопления продуктов LPO, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой) после прогрева в корнях проростков под влиянием кадаверина указывает на возможность активации антиоксидантной системы. И действительно, обработка кадаверином вызывала постепенное повышение активности SOD, каталазы и гваяколпероксидазы (рис. 5). При этом максимальный эффект проявлялся через 24 ч после начала воздействия кадаверина. После повреждающего нагрева активность SOD и гваяколпероксидазы изменялась несущественно, а активность каталазы снижалась. Обработка кадаверином способствовала сохранению активности SOD и каталазы в постстрессовый период, однако не влияла на активность гваяколпероксидазы (см. рис. 5). Для выяснения роли пероксида водорода и ферментативных систем, причастных к его генерации, в вызываемом кадаверином повышении активности SOD, каталазы и гваяколпероксидазы исследовали влияние DMTU, аминогуанидина и имидазола на активность этих ферментов после 24-часовой экспозиции в присутствии кадаверина. Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней 123 Рис. 4. Содержание в корнях продуктов LPO (а) и выживание проростков пшеницы (b) после повреждающего прогрева (M±mM). 1 - контроль; 2 - кадаверин (1 мМ); 3 - DMTU (150 мкМ); 4 - кадаверин (1 мМ) + DMTU (150 мкМ); 5 - аминогуанидин (1 мМ); 6 - кадаверин (1 мМ) + аминогуанидин (1 мМ); 7 - имидазол (10 мкМ); 8 - кадаверин (1 мМ) + имидазол (10 мкМ). Содержание продуктов LPO определяли через 24 ч, выживание проростков -через 3 суток после повреждающего прогрева. Разными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми статистически значимы (р < 0,05) [Fig. 4. LPO products content in roots (a) and survival of wheat seedlings (b) after damaging heating (M±mM): 1 - Control; 2 - Cadaverine (1 mM); 3 - DMTU (150 цМ); 4 - Cadaverine (1 mM) + DMTU (150 цМ); 5 - Aminoguanidine (1 mM); 6 - Cadaverine (1 mM) + Aminoguanidine (1 mM); 7 - Imidazole (10 цM); 8 - Cadaverine (1 mM) + Imidazole (10 цM). The content of LPO products was determined after 24 h, the survival of seedlings was determined 3 days after damaging heating. Different Latin letters denote values, the differences between which are statistically significant (p < 0.05] А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 124 Рис. 5. Динамика активности SOD (а) и каталазы (b) и гваяколпероксидазы (c) в корнях проростков пшеницы при действии кадаверина и повреждающего прогрева (M±mM). I-III - соответственно: через 2, 4 и 24 ч после начала обработки кадаверином, IV - через 24 ч после прогрева при 45 °С. 1 - контроль; 2 - кадаверин (1 мМ). Разными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми статистически значимы (p < 0,05) [Fig. 5. Dynamics of SOD (a), catalase (b) and guaiacol peroxidase (c) activity in roots of wheat seedlings under the action of cadaverine and damaging heating. I-III - respectively: 2, 4 and 24 h after the start of treatment with cadaverine, IV - 24 h after warming up at 45 °С. 1 - Control; 2 - Cadaverine (1 mM). Different Latin letters denote values, the differences between which are statistically significant (p < 0.05)] Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней 125 Рис. 6. Активность SOD (a), каталазы (b) и гваяколпероксидазы (c) в корнях проростков пшеницы при обработке кадаверином, DMTU, аминогуанидином и имидазолом (M±mM). 1 - контроль; 2 - кадаверин (1 мМ); 3 - DMTU (150 мкМ); 4 - кадаверин (1 мМ) + DMTU (150 мкМ); 5 - аминогуанидин (1 мМ); 6 - кадаверин (1 мМ) + аминогуанидин (1 мМ); 7 - имидазол (10 мкМ); 8 - кадаверин (1 мМ) + имидазол (10 мкМ). Обработку корней кадаверином проводили в течение 24 ч, DMTU и ингибиторы ферментов добавляли в среду инкубации корней за 2 ч до внесения кадаверина. Разными латинскими буквами обозначены величины, различия между которыми статистически значимы (р < 0,05) [Fig. 6. Activity of SOD (a), catalase (b), and guaiacol peroxidase (c) in roots of wheat seed lings when treating with cadaverine, DMTU, aminoguanidine and imidazole (M±mM). 1 - Control; 2 - Cadaverine (1 mM); 3 - DMTU (150 ^M); 4 - Cadaverine (1 mM) + DMTU (150 ^M); 5 - Aminoguanidine (1 mM); 6 - Cadaverine (1 mM) + Aminoguanidine (1 mM); 7 - Imidazole (10 ^M); 8 - Cadaverine (1 mM) + Imidazole (10 ^M). The roots were treated with cadaverine for 24 h; DMTM and enzyme inhibitors were added to the root incubation environment 2 h before the addition of cadaverine. Different Latin letters denote values, the differences between which are statistically significant (p < 0.05)] А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 126 Предварительная обработка DMTU не влияла на активность SOD и не устраняла ее повышение, вызываемое кадаверином (рис. 6, а). Ингибитор диаминоксидазы аминогуанидин сам по себе не оказывал влияния на активность SOD в корнях и не препятствовал ее повышению в присутствии кадаверина. Ингибитор НАДФН-оксидазы также существенно не влиял на величину активности SOD и ее изменение под влиянием кадаверина. Иные эффекты отмечались при оценке влияния исследуемых ингибиторов на активность каталазы в корнях проростков, обработанных кадаверином (рис. 6, b). DMTU не оказывал влияния на активность фермента, но устранял ее повышение, вызываемое кадаверином. Обработка аминогуанидином сама по себе немного снижала активность каталазы и полностью устраняла эффект ее увеличения в присутствии кадаверина. В то же время в варианте с имидазолом активность фермента уменьшалась незначительно, при этом ингибитор НАДФН-оксидазы практически не препятствовал эффекту повышения активности каталазы под влиянием кадаверина. Скавенджер пероксида водорода DMTU не оказывал существенного влияния на активность гваяколпероксидазы в корнях, но при этом нивелировал ее повышение, вызываемое кадаверином (рис. 6, c). Обработка аминогуанидином сама по себе вызывала некоторое повышение активности гваяколпероксидазы. В варианте с комбинацией кадаверина и аминогуанидина активность фермента немного ниже, чем в варианте с одним кадаверином, однако это различие статистически не значимо (р < 0,05). Имидазол не влиял на активность гваяколпероксидазы, но немного снижал эффект ее повышения, вызываемый кадаверином. Обсуждение результатов исследования В настоящей работе показано повышение теплоустойчивости проростков пшеницы под влиянием экзогенного кадаверина (см. рис. 1). Такой эффект кадаверина оказался зависимым от образования ROS и устранялся действием антиоксиданта DMTU (см. рис. 4). Основным ферментом, генерирующим пероксид водорода при обработке проростков кадаверином, по-видимому, является диаминоксидаза. На это указывает устранение вызываемого кадаверином повышения содержания пероксида водорода в корнях обработкой ингибитором диаминоксидазы аминогуанидином (см. рис. 3). Кроме того, в присутствии аминогуанидина не проявлялось влияние кадаверина на интегральные показатели - эффект окислительного стресса и выживание проростков после повреждающего нагрева (см. рис. 4). Другим мощным ферментативным источником ROS в растительных клетках может быть НАДФН-оксидаза [24]. Имеются данные, указывающие на возможность повышения ее активности под влиянием полиаминов, в частности диамина путресцина [25]. Однако влияние кадаверина на образование пероксида водорода не устранялось ингибитором НАДФН-оксидазы Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней 127 имидазолом (см. рис. 3). Этот ингибитор практически не влиял и на проявление стресс-протекторных эффектов кадаверина (см. рис. 4). Полученные результаты дают основания полагать наличие в реализации эффектов кадаверина механизмов, как связанных, так и не связанных с его превращением диаминоксидазой и образованием пероксида водорода. Так, повышение активности SOD, вызываемое кадаверином, не устранялось антиоксидантом DMTU и ингибиторами ферментов, генерирующих ROS (аминогуанидином и имидазолом) (см. рис. 6, а). Как уже отмечалось, в работе [15] показано, что эффект индуцирования кадаверином экспрессии гена Cu/Zn-SOD в клетках корнейM. crystallinum почти полностью сохранялся в присутствии аминогунидина. При этом экзогенный пероксид водорода значительно слабее по сравнению с кадаверином влиял на экспрессию гена Cu/ Zn-SOD. С учетом этих фактов авторы предположили, что кадаверин может непосредственно влиять на экспрессию гена Cu/Zn-SOD в корнях хрустальной травки. Таким образом, можно говорить о сходстве механизмов влияния кадаверина на активность SOD у двух таксономически отдаленных видов -M. crystallinum и T. aestivum. Следует, однако, отметить, что в наших экспериментах не анализировались экспрессия генов различных молекулярных форм SOD и электрофоретический спектр белков, обладающих каталитической активностью SOD. Как известно, среди форм SOD у большинства растений обычно доминируют Cu/Zn-содержащие изоформы, однако часть ферментативной активности связана и с наличием содержащихся в клеточных компартментах Fe- и Mn-SOD [26]. В связи с этим можно лишь предполагать, что кадаверин способен повышать активность каких-либо форм SOD и/или экспрессию соответствующих генов, действуя без участия пероксида водорода. Кроме того, нельзя полностью исключить, что зафиксированное нами повышение активности SOD под влиянием кадаверина могло быть обусловлено возможным усилением генерации супероксидного анион-радикала. Однако такая причина повышения активности SOD под влиянием кадаверина представляется маловероятной, поскольку этот эффект не устранялся имидазолом - ингибитором НАДФН-оксидазы, которая считается одним из основных ферментов, генерирующих супероксидный анион-радикал [24]. Что касается других исследованных нами антиоксидантных ферментов -каталазы и гваяколпероксидазы, то вызываемые кадаверином модификации их активности, по-видимому, опосредованы пероксидом водорода. Так, повышение активности каталазы под влиянием кадаверина не происходило в присутствии скавенджера H2O2 DMTU и ингибитора диаминоксидазы аминогуанидина (см. рис. 6, b). В то же время ингибитор НАДФН-оксидазы имидазол не устранял такой эффект кадаверина. Можно полагать, что повышение активности каталазы является следствием увеличения содержания пероксида водорода, происходящего в результате окисления кадаверина диаминоксидазой. Следует отметить, что у M. crystallinum вызываемое кадаверином повышение содержания пероксида водорода и активности каталазы в А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 128 корнях также подавлялось аминогуанидином [17]. Также не исключено, что еще одной причиной повышения содержания пероксида водорода в корнях при действии кадаверина может быть увеличение активности SOD. Повышение активности гваяколпероксидазы в корнях проростков пшеницы, которое происходило при обработке кадаверином, также устранялось действием DMTU (см. рис. 6, c). Участие диаминоксидазы в этом процессе доказать оказалось сложно вследствие хотя и небольшого, но повышения активности гваяколпероксидазы под влиянием ингибитора диамиоксидазы аминогуанидина. В культуре тканей побегов тополя также показано некоторое увеличение активности этого фермента при внесении в среду аминогуанидина [27]. Примечательно, что у растений M. crystallinum вызываемое кадаверином повышение активности пероксидазы устранялось аминогуанидином [28]. Возможно, что этот ингибитор диаминоксидазы оказывает неспецифическое влияние на активность пероксидазы, проявление которого может зависеть от видовых особенностей растений. Еще одной сложностью интерпретации эффектов аминогуанидина является его способность ингибировать образование оксида азота [29], который, наряду с пероксидом водорода, является активным модификатором антиоксидантных ферментов [30]. В целом в связи с наличием функциональных связей ROS с другими посредниками можно предположить, что некоторые физиологические эффекты ди- и полиаминов могут быть обусловлены образованием не только ROS, но и оксида азота (NO). Так, при действии путресцина на проростки пшеницы увеличивалось содержание NO в корнях, а его скавенджер PTIO (2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide) в значительной степени угнетал развитие теплоустойчивости проростков пшеницы, индуцируемое этим диамином [31]. Возможную роль NO в реализации эффектов кадаверина еще предстоит исследовать. Еще одним сигнальным посредником, задействованным в реализации кадаверина, как и других полиаминов, может быть кальций, который относится к универсальным мессенджерам. Его выход в апопласт зарегистрирован под влиянием путресцина в корнях гороха [32]. Также показана способность полиаминов вытеснять кальций из комплексов с пектиновыми веществами клеточных стенок [33]. Есть сведения и о прямом влиянии содержащегося в апопласте спермина на состояние катионных каналов растительных клеток [34]. В наших экспериментах показана зависимость от кальциевого гомеостаза образования ROS в корнях проростков пшеницы при действии путресцина [35]. В то же время нам не известны специальные исследования влияния кадаверина на кальциевый гомеостаз растительных клеток. Безусловно, что обсуждаемые механизмы не исключают и возможности прямого влияния кадаверина на биомакромолекулы и, как следствие, на функционирование отдельных белков и экспрессию генов. Как уже отмечалось, в работе Е.Е. Ароновой и соавт. [15] показана возможность независимого от ROS влияния кадавернина на экспрессию гена цитозольной Влияние кадаверина на редокс-гомеостаз корней 129 Cu/Zn-SOD у хрустальной травки. В нашей работе установлено повышение экзогенным кадаверином активности SOD в корнях пшеницы в присутствии ингибитора диаминоксидазы аминогуанидина и скавенджера пероксида водорода DMTU (см. рис. 6, а), что также косвенно указывает на возможность реализации эффектов кадаверина без участия ROS, образующихся при его окислении диаминоксидазой. Кроме того, одна из составляющих стресспротекторного действия полиаминов, в том числе и кадаверина, может заключаться в прямых антиоксидантных эффектах. В частности, сообщается о его способности ингибировать окислительную деградацию ДНК [36]. В целом же, полученные экспериментальные данные показывают важную роль сигнальных путей, в которых задействованы ROS, в реализации протекторного действия кадаверина на проростки пшеницы при тепловом стрессе. Ранее на такой же модели мы изучали влияние путресцина на редокс-гомеостаз и устойчивость проростков пшеницы к гипертермии [26]. Полученные результаты позволяют говорить о значительном сходстве эффектов экзогенных кадаверина и путресцина. Обработка проростков этими диаминами повышала их теплоустойчивость. В обоих случаях под влиянием диаминов происходило повышение активности антиоксидантных ферментов (SOD, каталазы и гвая-колпероксидазы). Влияние обоих соединений на теплоустойчивость практически не проявлялось в присутствии скавенджера пероксида водорода DMTU. Однако при действии путресцина эффекты усиления образования ROS, увеличения активности антиоксидантных ферментов и повышения теплоустойчивости проростков устранялись не только DMTU и ингибитором диаминок-сидазы аминогуанидином, но и ингибитором БАДФH-оксидазы имидазолом. Повышение активности НАДФН-оксидазы у растений арабидопсиса зафиксировано и под влиянием экзогенного спермидина [37]. Не исключено, что вклад ROS, образуемых разными ферментативными системами при действии полиаминов, может зависеть от природы последних. Обсуждая стресс-протекторное действие кадаверина, зафиксированное в нашей работе, следует отметить, что его специфичность требует специальных исследований, поскольку при его метаболизации могут образовываться другие соединения с физиологической активностью, в частности путресцин [38], что создает серьезные трудности в изучении его «самостоятельных» стресс-протекторных эффектов [39]. Заключение Показан эффект повышения теплоустойчивости проростков пшеницы экзогенным диамином кадаверином. Важной составляющей его стресспротекторного действия, по-видимому, является активация ферментативной антиоксидантной системы. При этом в качестве одного из сигнальных посредников, задействованных в реализации защитного действия кадаверина, выступает пероксид водорода, который образуется при окислении кадаве- А.И. Кокорев, Ю.Е. Колупаев, М.А. Шкляревский, А.А. Луговая 130 рина диаминоксидазой. Об участии диаминоксидазы и ROS в проявлении эффектов кадаверина свидетельствует устранение его влияния на теплоустойчивость проростков пшеницы и активность каталазы и гваяколперок-сидазы скавенджером H2O2 DMTU и отчасти ингибитором диаминоксидазы аминогуанидином. Наряду с этим, модификация кадаверином активности SOD в корнях проростков пшеницы, по-видимому, может происходить без участия ROS, образующихся под действием диаминоксидазы, поскольку не устраняется антиоксидантом DMTU и ингибитором диаминоксидазы аминогуанидином.

Скачать электронную версию публикации