DNA polymorphism and genetic diversity of the oak lace bug (Corythucha arcuata Say) population in Krasnodar Krai.pdf Сокращения: GI - генетическая идентичность [Genetic Identity]; GD - генетические расстояния [Genetic Distances]. Для цитирования: Беседина Е.Н., Киль В.И. ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции дубовой кружевницы (Corythucha arcuata Say) в Краснодарском крае // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2021. № 55. С. 42-ХХ. doi: 10.17223/19988591/55/3 Введение Клоп дубовая кружевница Corythucha arcuata Say (Heteroptera: Tingidae) - опасный инвазивный вид, родина которого Северная Америка [1]. Отсутствие эффективных средств и методов борьбы с ним привело к ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции 43 тому, что адвентивный вредитель поставил под угрозу существование древесных экостистем стран Западной, Восточной, Южной Европы и Передней Азии [2-4]. После первого его обнаружения в 2015 г. на территории России в Краснодарском крае клоп значительно расширил свой формирующийся инвазионный ареал, и в течение двух лет его вредоносность приобрела характер пандемии [5-7]. К настоящему времени вредитель стремительно распространился на Северном Кавказе, рассматриваемом в административных границах Краснодарского края, Республики Адыгея, а также прилегающих территорий Ставропольского края, Ростовской области, Республик Карачаево-Черкесия и Абхазия [8-10]. Площадь очагов его массового размножения только в государственных лесах на территории края уже в 2016 г. превысила 372 тыс. га, а площадь инвазии, определяемая по крайним находкам C. arcuata, достигла 1 300 тыс. га (при этом общая площадь лесов Краснодарского края составляет 1 683,1 тыс. га), в 2017 г. - 620 тыс. га, в 2018 г. - 742 тыс. га [10-11]. С 1 июля 2017 г. клоп дубовая кружевница внесен в перечень карантинных объектов на территории Российской Федерации [12]. Дубовая кружевница повреждает целый ряд ценнейших древесных и кустарниковых пород [10-11, 13-15]. Огромная вредоносность клопа, определяемая полным поражением всей листовой поверхности, приводит к нарушению фотосинтеза, что прекращает поглощение углекислого газа и выделение кислорода, нормальный рост и развитие растений и влечет нарушение равновесия экосистем [16]. За вегетационный период развиваются 3-4 генерации вредителя [10, 17]. Масштабной инвазии C. arcuata на Северном Кавказе способствуют пластичность сезонного цикла, миграционная активность и полифагия имаго, а также развитая транспортная инфраструктура, поддерживающая значительный грузопоток из потенциальных источников завоза чужеродных вредных организмов к естественным лесам [10]. Для успешного осуществления программ по защите растений от вредителей необходимо изучение биологии и генетики популяций вредных насекомых. Знание популяционной генетики поможет усовершенствовать диагностику, определить пути вторжения, миграции вида и разработать механизмы их предотвращения. В литературе имеются данные о секвенировании полного митохондриального генома платановой кружевницы Corythucha ciliata (Say, 1832) [18], а также митохондриального генома и сегмента ядерного рибосомного гена другого представителя этого семейства Pseudacysta perseae (Heidemann, 1908) [19]. Филогенетические исследования семейства Tingidae, включая виды C. ciliata и Stephanitis pyri (F., 1775), проведены авторами на основе сравнительного анализа последовательности нуклеотидов участков ядерных и митохондриальных генов (COI, Leu-tRNA, COII, 16S и 28S rRNA) [20]. В другом исследовании с использованием FISH-картирования с маркером 18S рДНК изучены Stephanitis caucasica (Kiritshenko, 1939), S. pyri, Е.Н. Беседина, В.И. Киль 44 Physatocheila confinis (Horvath, 1905), Lasiacantha capucina (Germar, 1836), Dictyla rotundata (Herrich-Schaffer, 1835) и Dictyla echii (Schrank, 1782) [21]. Для определения путей миграции и инвазии C. ciliata проведено изучение генетической структуры азиатских и европейских популяций платановой кружевницы с помощью анализа митохондриальных последовательностей ДНК и микросателлитов [22]. Проведенный анализ подтвердил широко распространенную вторичную инвазию, происходящую от первичной инвазивной популяции, что наблюдалось при расселении других инвазивных насекомых, включая Frankliniella occidentalis (Perg., 1895) [23], Solenopsis invicta (Buren, 1972) [24] и Diabrotica virgifera virgifera (LeConte, 1858) [25]. Современные геномные подходы могут предоставить возможность для разработки новых стратегий управления численностью насекомых, которые представляют непосредственную угрозу для окружающей среды. Так, у платановой кружевницы изучены уровни экспрессии генов, контролирующие особенности метаморфоза и механизмы половой детерминации. Эти гены, отвечающие за синтез ювенильных гормонов, хемосенсорного и кутикуляр-ного белков, могут служить молекулярными мишенями для новых инсектицидов [26]. Анализ изменчивости генетической структуры популяций, как одного из направлений популяционной генетики насекомых, включает оценку генетического разнообразия, ДНК-полиморфизма и генетического сходства изучаемых объектов. Один из подходов к изучению генетики популяций -использование молекулярных маркеров, представляющих полиморфные последовательности ДНК, которые могут быть обнаружены с помощью различных модификаций метода ПЦР, включая RAPD-PCR (randomly amplified DNA polymerase chain reaction) - случайным образом амплифицированная ДНК [27]. Данный подход относительно прост в сравнении с другими вариантами ПЦР, так как не требует знания первичной последовательности ДНК [28]. Проблемы с относительно низкой воспроизводимостью этого метода могут быть устранены подбором высокоспецифичных к ДНК RAPD-праймеров [29-30]. Подобный подход с успехом применяется при сравнительном анализе ДНК-полиморфизма не только различных видов клопов, но и других отрядов насекомых, что позволяет изучать генетику популяций вредных насекомых наряду с использованием других маркерных систем ПЦР [31-32]. Цель работы - изучение молекулярно-генетической структуры локальных популяций дубовой кружевницы C. arcuata в Краснодарском крае по RAPD-маркерам для оценки их генетического сходства. Материалы и методики исследования Исследования проведены в 2020 г. на территориях инвазивного распространения клопа дубовая кружевница в Краснодарском крае: города Краснодар, Тихорецк, Крымск и Сочи. Объект исследований - выборки насекомых ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции 45 (n=20) из природной популяции дубовой кружевницы выбранных лока-литетов. Общее количество исследованных образцов - 240. Сбор клопов C. arcuata осуществлен на модельных деревьях дуба черешчатого (Quercus robur L.). Выборка деревьев - 10 дубов из каждого локалитета. Лабораторные исследования выполнены на базе сектора биотехнологии ФГБНУ «Федеральный научный центр биологической защиты растений» (г. Краснодар). Выделение ДНК из целых особей насекомых (имаго), амплификация (RAPD-PCR) и электрофорез проведены по разработанной нами ранее методике [33]. RAPD-амплификация проведена в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Tris-HCl, pH 9,0; 50 мМ KCl; 3,0 мМ MgCl2; 50 мкМ каждого dNTP; 0,8 мкМ праймера; 0,5 ед. Taq-полимеразы и 20 нг ДНК. Все компоненты взяты из набора для амплификации («Силекс», Россия). В RAPD-PCR использованы высокоспецифичные для ДНК клопа дубовой кружевницы праймеры: ОРА07, ОРА09, ОРА18 («Евроген», Россия) [34-36]. Амплификация проведена на приборе «iCycler» («Bio Rad», США), в следующих режимах: 1) 3 минуты предварительная денатурация при 94 °С; 2) 36 циклов: - 20 секунд денатурация при 94 °С; - 20 секунд отжиг при 36 °С; - 60 секунд элонгация при 72 °С; 3) 10 минут конечный синтез при 72 °С. Амплифицированные фрагменты ДНК разделены электрофорезом в 1,8%-ном агарозном геле в буфере ТВЕ (45 мМ Трис-бората и 1 мМ ЭДТА) с дальнейшим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Продукты амплификации визуализированы с помощью системы гель-документирования GelDoc XR+ («Bio Rad», США). В качестве маркера молекулярного веса ДНК использован Gene Ruler 100 bp DNA Ladder («Thermo Fisher Scientific», США). Оценка ДНК-полиморфизма, генетического разнообразия и генетического сходства проведена по информационным индексам Nei и Shannon с помощью компьютерной программы POPGENE (version 1.31) [37]. Статистическая значимость различий между средними значениями по выборке оценена по t-критерию Стьюдента (р < 0,05). Результаты исследования и обсуждение Одно из направлений популяционной генетики насекомых - изучение изменчивости генетической структуры популяций, что включает в себя оценку генетического разнообразия, ДНК-полиморфизма и генетического сходства изучаемых объектов. Это позволяет судить о потоке генов, т.е. обмене генетическим материалом внутри популяции или между популяциями, и опре- Е.Н. Беседина, В.И. Киль 46 делить степень их генетической дифференциации: представляют они собой разные популяции или одну единую популяцию и являются в этом случае внутрипопуляционными группировками. Сиспользованием RAPD-PCR-системы марюфосания изучена молеку-лярно-генетическаяструкгура локальныхпагрщяцсй добовойиружевшщы в Кррснодрсскомкрае. Прсседтн RAPD-анализ географических выборок насекомых из вородов Краснодар, Тирорецк, Креімик я Ссчи. В общей тлож-нтстис испляозрванлет трех праймеров полученоЗ9 RAPDoeoKycoB (слое. 1, твбл. I,. Рис.1. Электрофореграммы продуктов RAPD-PCR Corythuchaarcuata в1,8%агарозном гелеспраймерами ОРА07,ОРА09и ОРА18.Дорожки -ампликоны ДНК насекомых различныхгеографическихвыборок: 1-5- г Тихорецк; 6-10-г Краснодар; 11-15 - г Крымск; 16-20-г. Сочи. М-маркеры молекулярных масс, п.н. [Fig. 1. Electropherograms of RAPD-PCR products of Corythucha arcuata in 1.8%agarosegelwithprimersOPA07,OPA09and OPA18. Lanes -DNA amplicons ofinsectsfrom variousgeographicsamples:1-5- Tikhoretsk; 6-10 - Krasnodar; 11-15 - Krymsk; 16-20 - Sochi. M - Molecular weight markers, bp] ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие популяции 47 Таблица 1 [Table 1] Число локусов на праймер и размеры ДНК-фрагментов в RAPD-анализе Corythucha arcuata [Number of loci per primer and sizes of DNA fragments in RAPD analysis of Corythucha arcuata] RAPDпраймер [RAPD-primer] По следовательно сть нуклеотидов 5'-3' [Seauence of nucleotides 5'-3'] Число локусов [Number of loci] Размеры ДНК-фрагментов, п.н. [Sizes of DNA fragments, bp] OPA 07 GAAACGGGTG 14 =1500-200 ОРА 09 GGGTAACGCC 12 =1500-200 ОРА 18 AGGTGACCGT 13 =1400-300 Молекулярно-генетический анализ C. arcuata выявил в целом высокие уровни ДНК-полиморфизма (Р = 100%) и генетического разнообразия (Н = 0,26-0,29, по Nei) в популяции дубовой кружевницы и отсутствие различий между выборками по этим показателям (табл. 2-3). Таблица 2 [Table 2] Генетическое разнообразие и ДНК-полиморфизм внутрипопуляционных группировок Corythucha arcuata по RAPD-локусам (n=39) [Genetic diversity and DNA polymorphism of Corythucha arcuata intra-population groupings at RAPD loci (n=39)] Внутрипопуляционная группировка [Intra-population grouping] p (%) Na±SD* Ne±SD* H±SD* I±SD* Краснодарская [Krasnodar] 97,4 1,97±0,16 1,47±0,31 0,29±0,15 0,45±0,19 Тихорецкая [Tikhoretsk] 92,3 1,92±0,27 1,44±0,31 0,27±0,16 0,42±0,21 Крымская [Krymsk] 89,7 1,90±0,31 1,42±0,31 0,26±0,16 0,41±0,22 Сочинская [Sochi] 87,2 1,87±0,34 1,47±0,36 0,28±0,18 0,42±0,24 Примечание. * - статистически не значимые различия; P - % полиморфных локу сов в популяционной группировке; Na - число аллелей на локус; Ne - эффективное число аллелей на локус; Н - генетическое разнообразие по Nei; I - генетическое разнообразие по Shannon; ±SD - стандартное отклонение. [Note. * Іфакі

Скачать электронную версию публикации