Spread of Dirofilariae (Spirurida, Onchocercidae) in the Natural Populations of Malaria Mosquitos (Diptera, Culicidae) i.pdf Введение Современный этап развития биосферы характеризуется потеплением климата, влияющим на формирование экосистем, и провоцирует изменение границ ареалов живых организмов [1, 2]. Не являются исключением и паразитические виды, часть из которых относится к возбудителям заболеваний человека и животных и их переносчикам [3-6]. Паразитические нематоды Dirofilaria repens (Railliet et Henry 1891) и D. immitis (Leidy, 1956) семейства Onchocercidae (Nematoda, Spirurida) -инвазивные виды для Западной Сибири. Они относятся к группе возбудителей «вновь возникающих» и «забытых» заболеваний. Дирофилярии -130 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий гетероксенные биогельминты, в имагинальной фазе паразитирующие у собак, кошек, других представителей отряда Carnivora и человека. D. im-mitis вызывает легочный (сердечный), а D. repens - подкожный (глазной) дирофиляриоз человека и собак, что стало в последние десятилетия серьезной медицинской и ветеринарной проблемой в России [7]. По международным оценкам, Россия - одна из наименее благополучных стран в отношении дирофиляриоза человека [8, 9]. В Западной Сибири это заболевание регистрируется с 1989 г. в Алтайском крае, спустя 10 лет - в Кургане, Новосибирске и Омске, а еще через 10-15 лет - в Ханты-Мансийске, Прио-бье, Красноярске, Томске и Колпашеве [10-16]. Расселение дирофилярий связано с промежуточным хозяином. При укусе зараженного животного комаром микрофилярии проникают в пищеварительный тракт и мальпигиевы сосуды переносчика, дважды линяют, мигрируют в хоботок и через укус заражают следующее животное или человека. Возможность инвазии экспериментально подтверждена для 70 с лишним представителей сем. Culicidae - рр. Anopheles, Aedes, Coquillettidae, Culex, Culiseta, Uranotaenia. В природных условиях разнообразие комаров, способных выдержать развитие паразита до инвазивной стадии, значительно меньше. Эффективность передачи дирофиляриоза определяется размером хозяина, продолжительностью его жизни, наличием внутренних механических, биохимических и физиологических механизмов элиминации паразита, избирательностью при выборе прокормителя и (или) времени нападения - признакам, которые делят переносчиков на основных и второстепенных [17]. Поэтому необходимо выявление и детальное изучение векторных видов на исследуемой территории. Адаптация к местным условиям у дирофилярий формируется на личиночной стадии, так как микрофилярии подвержены воздействию внешней среды и ее изменениям в связи с эктотермностью промежуточного хозяина. Определяющий фактор адаптации - температура: ареал распространения дирофилярий связывают с изотермой июля +14 °С [4]. Для вызревания микрофиляриям необходимо набрать сумму эффективных температур в 130 градусо-суток [18]. Температура и гостальное влияние отмечены как модифицирующие темпы развития и вирулентность паразита [19]. Сравнительно невысокая продолжительность жизни взрослых дирофилярий - от двух до семи лет [17, 20] - обеспечивает виду быструю смену поколений и высокую пластичность в изменчивой среде. Малярийные комары Anopheles подгруппы Maculipennis известны как эффективные переносчики дирофилярий в умеренном поясе Северного полушария [17, 21]. Многие виды этой подгруппы синантропны - в сельской местности и в частном секторе городов используют постройки человека в качестве дневок летом, а также - укрытий зимой. Это делает их одной из наиболее проблемных групп переносчиков. Подгруппа включает 11 видов [22, 23] и среди них по крайней мере шесть - An. atroparvus, An. maculipennis, An. sacharovi, An. messeae и An. daciae [24-27], а также An. beklemishevi [28] способны переносить дирофилярий. В Томской области 131 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics обитают четыре вида малярийных комаров, три из которых - An. beklemi-shevi, An. messeae и An. daciae - представители подгруппы Maculipennis и один, An. claviger, - группы claviger [28, 29]. Недавнее появление надежных молекулярно-генетических маркеров [30, 31] позволило однозначно определять видовую принадлежность критического вида An. daciae, что открыло возможность изучения не только путей его экспансии из Европы в Сибирь, но и трансмиссивного потенциала. Целью данного исследования было изучение распределения паразитических нематод D. repens и D. immitis в природных популяциях малярийных комаров Томской области, а также оценка риска распространения дирофиляриоза в свете потепления климата. Материалы и методики исследования Были сделаны 64 выборки кровососущих комаров в 36 населенных пунктах Томской области в течение сезонов 2018-2020 гг.: г. Томск (11.08.20) , с. Коларово (21.07.18, 30.08.18, 11.09.18, 30.05.19, 11.06.19, 21.06.19, 11.07.19, 31.07.19, 09.08.19, 19.08.19, 03.09.19, 10.06.20, 29.06.20, 14.07.20, 11.08.20, 29.08.20), с. Яр (02.07.19, 16.08.19), с. Курлек (14.08.19), с. Тегульдет (15.06.19, 07.07.19, 21.05.20), с. Черный Яр (21.05.20), с. Зырянское (21.05.20), с. Белый Яр (23.06.19, 28.05.20), с. Степановка (28.05.20) , с. Клюквинка (28.05.20), с. Бугры (04.06.20), с. Кирзавод (04.06.20) , с. М. Нестерово (04.06.20, 17.07.20), с. Новоселово (23.06.19, 02.07.20), с. Волково (22.07.19), с. Тогур (22.07.19, 02.07.20), с. Пасека (04.06.20) , с. Чажемто (04.06.20), с. Инкино (17.07.20), с. Б. Саровка (02.07.20) , с. Бакчар (17.08.19, 18.06.20), с. Чаинск (23.07.18), с. Подгорное (18.06.20) , с. Молчаново (18.06.20), с. Кривошеино (11.06.20), с. Батурино (25.06.20) , с. Первомайское (25.06.20), с. Б. Грива (16.07.20), с. Новоюгино (16.07.20) , с. Каргасок (16.07.20), г. Стрежевой (23.07.20, 24.07.20), с. Александровское (24.07.20), с. Кожевниково (27.08.20), с. Новопокровка (27.08.20) , с. Сафроновка (27.08.20), с. Трубачево (27.08.20). 62 выборки были собраны в местах дневок малярийных комаров - в стайках для скота частных хозяйств. Комаров собирали с потолка и стен с помощью химической стеклянной пробирки и помещали в садок. Две выборки из г. Томска и г. Стрежевого сделали вблизи частной застройки энтомологическим сачком в вечернее время. Комаров перевозили в живом виде в лабораторию для анализа и, если требовалось, хранили ночь при температуре +4 °С. Комаров диссектировали на предметном стекле в капле фосфатного буфера, выделяли кишечник и мальпигиевы сосуды, накрывали покровным стеклом и исследовали под микроскопом Primo Star plus (Carl Zeiss, Германия), используя объективы 5*, 10* и 40* для выявления микрофилярий, определения интенсивности инвазии и физиологического состояния паразита. Случаи заражения документировали с помощью фото- и видеосъемки используя микроскоп AxioImager A1, цифровую камеру MRc5 и программное обеспечение AxioVision 4.8.1 (Carl Zeiss, Германия). Останки 132 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий зараженных самок и смывы с предметных стекол, содержащие нематод, фиксировали отдельно в 96% этаноле. Для определения видов нематод и комаров фиксированный материал высушивали и гомогенизировали в STE-буфере [32]. Для постановки ПЦР использовали универсальные праймеры, специфичные к району внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомальных генов (ITS2) D. repens, D. immitis и других паразитических нематод, а также праймеры, комплементарные к гену COI митохондриальной ДНК D. repens и D. immitis [33]. Видовую принадлежность зараженных самок An. daciae, An. messeae и An. beklemishevi устанавливали с помощью ПЦР-ПДРФ анализа ITS2 комара. Фрагмент ITS2 ам-плифицировали, используя праймеры к 5,8S и 28S рДНК [30], рестрикцию проводили эндонуклеазой рестрикции Rsa I [31] согласно предложенным протоколам. Видовую диагностику немалярийных комаров не проводили. Экстенсивность инвазии комаров в выборке рассчитывается как отношение числа зараженных особей к общему числу проанализированных, в процентах. При анализе многолетней динамики температуры в Томской области использовали архивы сайта «Погода и климат» (http://www.pogodaiklimat.ru/) за 1976-2020 гг. Число оборотов инвазии (ОИ) рассчитывается как отношение суммы эффективных температур за сезон (СЭТ) к 130 единицам развития дирофилярий (ЕРД) [34]. Статистическая значимость различий определялась с помощью критерия хи-квадрат в случаях, когда происходило сравнение ожидаемых и наблюдаемых частот особей, и t-критерия Стьюдента -для сравнения независимых выборок. Результаты исследования В течение трех сезонов 2018-2020 гг. обследованы все 16 районов Томской области и сделано 64 выборки кровососущих комаров в 36 населенных пунктах (рис. 1). Всего была вскрыта 7 591 самка, 159 из которых оказались инвазирова-ны (2,1±0,2%). Зараженные самки обнаружены в 44 выборках из 64 (68,8±5,8%) в 21 населенном пункте из 36 (58,3±8,2%) и в 12 районах Томской области из 16. Экстенсивность инвазии (ЭИ) варьировала от 0 до 8,3% (c. Тогур, Колпашевского района, 22.07.19). Однако если исключить из подсчета диапаузирующих самок, которые в передаче инвазии не участвуют, то ЭИ достигала 12,4% (с. Коларово, Томского района, 31.08.18). Средняя ЭИ была выше для Тегульдетского района (3,8±1,3%, см. рис. 1). В Молчановском, Шегарском, Первомайском и Бакчарском районах инвазий не было обнаружено. Самки немалярийных кровососущих комаров в небольшом количестве попадались попутно в стайках и ни в одном случае не были заражены дирофиляриями. В г. Томске и г. Стрежевом выборки немалярийных комаров были взяты вне стаек с целью сравнения уровня зараженности малярийных и немалярийных комаров. Выборка немалярийных комаров из г. Стрежевого 23.07.20 (n = 98) оказалась свободной от дирофилярий, тогда как выборка из г. Томска (ул. Мостовая) 11.08.20 (n = 92) обнаружила небольшое заражение 1,1±1,1%. 133 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics iStrezhevoy .Aleksandrovskoe Klukvinki Stepanovka NovoyuginoQ B. Griva* Bugry 9 Kirzavod J M. Nesterovo Inkino КО j^Paseka rxui • О. ^Novoselovo Volkovo^ / T°9ur \\ B.Sarovka 2- 215 145 3551 958 _Chazhemto\\ Podgornoe*C Chainsk Molchanovo Baturino IKrivosheino Bakchar. Trubachevo / • • Pervomayskoe • jji ^Cherniy £ypZy rvanskoe/ Teguldet _^Safronovkaj Kozhevnikovo i Novopokrovka 56°N *Kzfo Kolarovo ► Л Kurlek86°E 'Yar max 299 min 780 498 I I T"_I I I w- I I I I I r,- I .... I Teg Asn Tom Kol Zyr Ver Chn Kar Krv Kzh Par Aik Рис. 1. Географическое распространение дирофилярий (a) и экстенсивность инвазии кровососущих комаров в Томской области (b) (по оси абсцисс - «Районы», по оси ординат - «Экстенсивность инвазии, %»). Районы Томской области: Teg - Тегульдетский, Asn - Асиновский, Tom - Томский, Kol - Колпашевский, Zyr - Зырянский, Ver - Верхнекетский, Chn - Чаинский, Kar - Каргасокский, Krv - Кривошеинский, Kzh - Кожевниковский, Par - Парабельский, Alk - Александровский. Населенные пункты, в которых были обнаружены зараженные комары, обозначены точками красного цвета, иначе - точками черного цвета. EI - экстенсивность инвазии (доля зараженных особей в выборке); ±m - ошибка доли; max, min - максимальная и минимальная экстенсивности инвазии, соответственно. N - число проанализированных комаров. В Бакчарском (Bak), Первомайском (Per), Молчановском (Mol) и Шегарском (Shg) районах инвазии не обнаружено [Fig. 1. Geographic distribution of dirofilariae (a) and invasion extensiveness of blood-sucking mosquitoes in Tomsk oblast (b) (on the Х-axis: "Regions", on the Y-axis - "Extensiveness of invasion, %"). Tomsk oblast regions: Teg - Teguldetskiy, Asn - Asinovskiy, Tom - Tomskiy, Kol - Kolpashevskiy, Zyr - Zyryanskiy, Ver - Verhneketskiy, Chn - Chainskiy, Kar - Kargasokskiy, Krv - Krivosheinskiy, Kzh - Kozhevnikovskiy, Par - Parabelskiy, Alk - Aleksandrovskiy. Localities, where infected mosquitoes were collected, indicated by the red dots, otherwise - by the black dots. EI - extensiveness of invasion (proportion of infected individuals in a sample); ±m - proportion error; max, min - relatively maximal and minimal extensiveness of invasion in the samples from the locality. N - total number of mosquitoes were analysed. There are no invasions of mosquitoes have been detected in Bakchar (Bak), Pervomayskiy (Per), Molchanovskiy (Mol) and Shegarskiy (Shg) regions] 134 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий Популяции, собранные на правом берегу Оби, имели заражение в 3,7 раза выше, чем на левом берегу (рис. 2). Рис. 2. Экстенсивность инвазии малярийных комаров дирофиляриями на правом (R) и левом (L) берегах Оби в Томской области (по оси абсцисс: «Географические координаты (широта)»; по оси ординат: «Экстенсивность инвазии, %») [Fig. 1. Extensiveness of invasion of malaria mosquitoes by dirofilariae on the right (R) and the left (L) Ob River banks in Tomsk oblast. (On the Х-axis: "Geographical coordinates (latitude)", on the Y-axis: "Extensiveness of invasion, %")] Южнее 59-й параллели по обоим берегам Оби ЭИ имела тенденцию к увеличению с юга на север, хотя и в различной степени. Севернее 59-й параллели было изучено только две популяции, расположенные на разных берегах Оби - с. Александровское и г. Стрежевой, и хотя выборки были достаточны для обнаружения ЭИ ниже 1%, закономерность подтвердилась и в этом случае - зараженные комары обнаружены только в г. Стрежевом, на правом берегу Оби. В популяциях южнее 57° с.ш., где доминировали малярийные комары An. daciae, среди зараженных комаров выявлялись только представители этого вида в с. Зырянское, с. Коларово (2,9±0,3%), с. Курлек (1,5±1,5%) и с. Яр (2,9±1,4%). Вскрытые самки малярийных комаров севернее 57° с.ш. отнесены к трем видам подгруппы Maculipennis - An. beklemishevi, An. mes-seae и An. daciae (табл. 1). Как правило, виды имели высокую численность и были представлены в местообитаниях с разной частотой. Соотношение видов изменялось в течение сезона, в основном с преобладанием или значительной долей An. beklemishevi в первой половине сезона. Иногда эта закономерность нарушалась, как, например, в с. М. Нестерово, где в июне преобладал An. messeae, а в июле - An. beklemishevi, что было связано с низкими температурами июня. Два вида (An. daciae в с. Коларово и д. Сафроновка и An. beklemishevi в д. Б. Грива) отмечены нами в качестве переносчиков, так как их представители были заражены микрофиляриями (L3), локализован-135 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics ными в хоботке. Инфективных An. messeae не попалось, однако микрофи-лярии конца второго возраста (L2) встретились в самках с. Новоюгино, п. Каргасок, с. М. Нестерово и с. Б. Саровка. An. claviger встречался редко -по одной особи в г. Томске и д. Сафроновке, ни в одном случае заражение не отмечено. Таблица 1 [Table 1] Экстенсивность инвазии трех видов малярийных комаров дирофиляриями в местообитаниях севернее 57° с. ш. Томской области [Extensiveness of invasion of malaria mosquitoes by dirofilariae in the localities northerner 57° N lattitude in Tomsk region] Населенный пункт, координаты, дата [Localities names, coordinates, date] N ЭИ, % [EI,%] Показа тель [Indicator] Виды малярийных комаров [Malaria mosquitoes species] An. beklemishevi An. daciae An. messe-ae г. Стрежевой [Strezhevoy t.] (R) 60°44' N, 77°35' E, 23.07.2020 200 1,0±0,7 МК[ЫЫ] 59,0±3,5 14,5±2,5 26,5±3,1 ЭИ [EI] 0,8±0,8 0 1,9±1,9 п. Каргасок [Kargasok v.] (R) 59°03'28" N, 80°52'16" E, 16.07.2020 383 1,6±0,6 МК[ЫЫ] 49,1±2,6 18,5±2,0 32,4±2,4 ЭИ [EI] 1,1±0,8 1,4± 1,4 2,4±1,4 с. Малое Нестерово [Maloye Nesterovo v.] (L) 58°39'45" N, 81°34'46" E, 04.06.2020 383 0,5±0,4 МК[ЫЫ] 12,3±1,7 14,4±1,8 73,4±2,3 ЭИ [EI] 0 1,8±1,8 0,4±0,4 с. Малое Нестерово [Maloye Nesterovo v.] (L), 17.07.2020 319 1,6±0,7 МК[ЫЫ] 58,0±2,8 16,0±2,1 26,0±2,5 ЭИ [EI] 1,1±0,8 2,0±1,9 2,4±1,7 с. Белый Яр, с. Клюквин-ка [Beliy Yar v., Klukvinka v.] (R) 58°32'41" N, 85°52'12" E, 28.05.2020 199 2,5±1,1 МК[ЫЫ] 92,5±1,9 5,5±1,6 2,0±1,0 ЭИ [EI] 2,7±1,2 0 0 г. Колпашево [Kolpashevo t.] (R) 58°21'40" N, 82°50'18" E, 22.07.2019, 02.07.20 609 3,8±0,8 МК[ЫЫ] 58,3±2,0 14,1±2,0 27,6±1,8 ЭИ [EI] 1,7±0,7 4,7±2,3 7,7±2,1 с. Батурино [Baturino v.] (R) 57°45'16" N, 85°10'12" E, 25.06.2020 145 2,8±1,4 МК[ЫЫ] 49,7±4,2 2,1±1,2 48,3±4,1 ЭИ [EI] 1,4±1,4 33,3±27,2 2,9±2,0 с. Подгорное [Podgornoye v.] (L) 57°47' N, 82°39' E, 18.06.2020 177 2,3±1,1 МК[ЫЫ] 74,0±3,3 23,7±3,2 2,3±1,1 ЭИ [EI] 0 7,1±4,0 25,0±21,7 с. Кривошеино [Krivosheino v.] (L) 57°21' N, 83°56' E, 11.06.2020 213 1,4±0,8 МК[ЫЫ] 17,8±2,6 6,1±1,6 76,1±2,9 ЭИ [EI] 0 0 1,85±1,06 136 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий О к о н ч а н и е т а б л. 1 [Table 1 (end)] Населенный пункт, координаты, дата [Localities names, coordinates, date] N ЭИ, % [EI,%] Показа тель [Indicator] Виды малярийных комаров [Malaria mosquitoes species] An. beklemi shevi An. daciae An. messe-ae с. Тегульдет [Teguldet v.] (R) 57°18' N, 88°10' E, 15.06.19, 21.05.2020 136 5,9±2,0 МК[ММ] 9,6±2,5 19,1±3,4 71,3±3,9 ЭИ [EI] 0 3,9±3,8 7,2±2,6 с. Зырянское* [Zyryanskoye v.*] (R) 56°50' N, 86°37' E, 21.05.2020 43 2,3±2,3 МК[ММ] 18,6±5,9 72,1±6,8 9,3±4,4 ЭИ [EI] 0 3,2±3,2 0 Правый берег р. Обь [Right Ob River bank] 1331 3,2±0,5 МК[ММ] 56,4±1,4 14,0±1,0 29,6±1,3 ЭИ [EI] 1,7±0,5 3,8±1,4 5,8±1,2 Левый берег р. Обь [Left Ob River bank] 1475 1,4±0,3 МК[ММ] 39,9±1,3 15,7±1,0 44,3±1,3 ЭИ [EI] 0,7±0,3 2,6±1,0 1,5±0,5 Всего [Total] 2813 2,2±0,3 МК[ММ] 47,8±0,9 14,9±0,7 37,3±0,9 ЭИ [EI] 1,3±0,3 3,1±0,8 3,2±0,5 Примечание. N - объем выборки, ЭИ - экстенсивность инвазии (доля зараженных особей в выборке), МК - частота видов малярийных комаров (f±m,%), «R» и «L» - указание на расположение населенного пункта на правом или левом берегу Оби соответственно. * Несмотря на то что с. Зырянское расположено южнее 57° с. ш., этот населенный пункт был включен в таблицу ввиду его пограничного положения и относительно высокого видового разнообразия переносчиков. [Note. N - sample values, EI - the extensiveness of invasion (the proportion of invaded individuals in the sample), ММ - частоты видов малярийных комаров f±m,%), "R" and "L" - indicators of the location on the right or left Ob river banks relatively. * Despite of Zyryanskoye v. formally southerner 57° N it was shown, because it borderline position and relatively high vector species diversity]. Склонность к переносу микрофилярий малярийными комарами различалась в популяциях южнее и севернее 57° с.ш. В южной части области, где доминировали An. daciae - в выборках из с. Коларово, д. Сафроновка, с. Яр и с. Курлек, они составляли почти 100%. Севернее 57° с.ш., где доля An. daciae не превышала 23% (с. Подгорное), а основную часть популяций составили An. messeae и An. beklemishevi, зараженными оказались, в основном, An. messeae (3,2±0,5%, см. табл. 1). Доля An. beklemishevi в «северных» выборках составляла в среднем 45,4%, что больше, чем An. messeae (35,9%), тем не менее, ЭИ An. beklemishevi (1,3±0,2%) оказалась в 2,46 раза ниже, чем у An. messeae (%2 = 77,05; df = 1; p < 0 ,001). ЭИ разных видов комаров значимо различалась в зависимости от берега р. Оби. На правом берегу зараженными чаще оказывались An. messeae по сравнению с An. beklemishevi (p < 0,01), а на левом - An. daciae по сравнению с An. beklemishevi (%2 = 4,34; df = 1; p < 0,05). Как отмечалось выше, ЭИ малярийных комаров в целом изменялась по широте, однако тенденции зараженности в зависимости от индекса доминирования по каждому виду различались. С юга на север доля инвазированных An. daciae и An. messeae падала, а An. beklemishevi - возрастала. Определение видов дирофилярий в 159 образцах показало, что 152 из них - D. repens, в четырех (2,5±1,2%) обнаружены D. immitis (табл. 2). 137 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics Таблица 2 [Table 2] Виды дирофилярий и их промежуточных хозяев - малярийных комаров в местообитаниях севернее и южнее 57° с. ш. в Томской области [Dirofilaria species and its intermediate hosts northerner and southerner of 57° N latitude in Tomsk region] Виды малярийных комаров [Malaria mosquitoes species] Виды ди рофилярий [Dirofilaria species] Итого [Total] D. repens D. immitis D. repens + D. immitis* N 1 f±m, % N 1 f±m, % N 1 f±m, % N 1 f±m, % Южнее 57° сш. [southerner 57° N] An. daciae | 91 | 59,9±4,0 | 0 | 0 | 1 | 0,7±0,7 |92|60,5±4,0 Севернее 57° сш. [northerner 57° N] An. beklemishevi 14 9,2±2,3 0 0 1 0,7±0,7 15 9,9±2,4 An. daciae 11 7,2±2,1 0 0 1 0,7±0,7 12 7,9±2,2 An. messeae 32 21,1±3,3 1 0,7±0,7 0 0 33 21,7±3,3 Итого [Total] 148 97,4±1,3 1 0,7±0,7 3 2,0±1,1 152 100 Правый берег р. Оби [Right Ob River bank] 20 100 0 0 0 0 20 100 Левый берег р. Оби [Left Ob River bank] 39 90,7±4,4 1 2,3±2,3 3 7,0±3,9 43 100 Примечание. N - число зараженных комаров, f - доля комаров определенного вида в общем пуле зараженных D. repens, D. immitis, либо обоими видами одновременно (микстовая инвазия, *), m - ошибка доли. [Note. N - sample value, f - a proportion of mosquitoes of certain species in total number of invaded by D. repens, D. immitis or by both species simultaneously (mixture invasion, *), m - proportion error]. В трех образцах из четырех D. immitis обнаружена в составе микстинвазии - одновременном заражении комара двумя видами дирофилярий. Определение оставшихся семи образцов (4,4±1,6%) не дало результата. D. immitis в составе микстовых инвазий обнаружены в с. Зырянское (одна особь) и с. Новоселово (две особи). Единственный комар, зараженный D. immitis, был пойман в Б. Саровке. Таким образом, наиболее высокая концентрация D. immitis выявлена в Колпашевской метапопуляции (13,6±7,3%) севернее 57-й параллели (см. табл. 2). Все особи, зараженные D. immitis, регистрировались только на правом берегу Оби. Интенсивность инвазии (ИИ) варьировала от одной до ста и более на самку. В первой половине сезона выявлялись преимущественно личинки L1 (62,5±8,6%; p < 0,05), во второй - возросла доля L2 в целом (64,1±6,6%), конца L2 (17,0±5,2%; p < 0,01) и L3 (5,7±3,2%). Начальная ИИ L1, как правило, была высокой, но с возрастом снижалась, до конца L2 - начала L3 доживало не более 30-40 особей, до инвазивной стадии - 12-16 особей. У семи самок малярийного комара (4,4±1,6%) отмечена суперинвазия -повторное заражение в виде личинок на разных стадиях развития в одной особи комара (рис. 3). Суперинвазия обнаружена у трех видов - An. beklemishevi (0,2%), An. messeae (0,4%) и An. daciae (0,6%). Во всех случаях повторное заражение, судя по размерам микрофилярий, происходило через 1-3 гонотрофиче-138 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий ских цикла. Микстовая инвазия только однажды была связана с повторным заражением (в с. Новоселово), тогда как в остальных образцах являлась результатом передачи смешанного заражения от дефинитивного хозяина. Рис. 3. Суперинвазия микрофиляриями Dirofilaria repens самки малярийного комара Anopheles daciae, пойманной в с. Коларово 28 августа 2020 г. Gt - задняя кишка, MT - мальпигиевы сосуды, L1 - меланизированные микрофилярии L1; L1-L2 - микрофилярии конца L1 - начала L2; L3 - микрофилярии L3 перед миграцией в хоботок. Масштабная линейка 200 мкм [Fig. 3. Superinvasion by Dirofilaria repens microfilaries of the Malpighian tubules of malaria mosquito Anopheles daciae female, collected in Kolarovo v. on August 28, 2020. Gt - gut, MT - Malpighian tubules, L1 -melanized microfilariae on the L1 stage; L1-L2 -microfilariae on the end of L1 stage; L3 - microfilariae on the L3 stage before migration to proboscis. Scale bar 200 pm] Инвазия вызывала морфологические изменения мальпигиевых сосудов. Стенки зараженных сосудов у An. messeae и An. daciae становились прозрачными по мере роста микрофилярий, в 3-4 раза увеличивались в диаметре, неравномерно и по всей длине сосуда. Инвазия An. beklemishevi сопровождалась изменением морфологии локальных или дистальных районов сосудов и была не столь выраженной, как у An. messeae или An. daciae. Кроме того, размеры патологии зависели от числа вселившихся микрофи-лярий. Анализ данных динамики температур в 14 местообитаниях комаров в сезоне 2020 г. продемонстрировал уменьшение числа ОИ на 26% с юга (с. Кожевниково - 4,31) на север (г. Стрежевой - 3,19, рис. 4). Наблюдаемая на рис. 4 зависимость числа ОИ от широты соблюдалась не для всех местообитаний: так, в отдельных «северных» населенных 139 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics пунктах оказалось даже теплее, чем в некоторых «южных». Поскольку разница между с. Кожевниково и г. Стрежевым составляет 4,5 широтных градуса, при продвижении с юга на север СЭТ в среднем снижалась на 24,7 ЕРД (или 0,19 ОИ) на один широтный градус. Рис. 4. Изменение числа оборотов инвазии и экстенсивности инвазии с юга на север Томской области (по оси абсцисс: «Выборки», по левой оси ординат: «Число оборотов инвазии», по правой оси ординат: «Экстенсивность инвазии, %»). Снижение числа оборотов инвазии обозначено пунктирной серой линией и маркерами круглой формы, динамика изменения экстенсивности инвазии - сплошной черной линией и четырехугольными маркерами. Kzh - c. Кожевниково, c. Сафроновка и с. Новопокровка; Tom - с. Коларово, с. Яр, с. Курлек; Bat - с. Батурино; БУг - с. Белый Яр, Pod - c. Подгорное; Teg - с. Тегульдет; Kol - г. Колпашево; Par - с. М. Нестерово; Kar - с. Каргасок, с. Новоюгино, д. Б. Грива; Str - г. Стрежевой [Fig. 4. Change in the number of invasion circle and extensiveness of invasion from south to north of Tomsk oblast (on the Х-axis: "Samples", on the left У-axis: "Number of invasion circles", on the right У-axis: "Extensiveness of invasion, %"). The decreasing of numbers of invasion circles detected by the dotted gray line with circle markers, the variation of extensiveness of invasion - by the solid black line with square markers. Kzh - Kozhevnikovo v., Safronovka v. and Novopokrovka v.; Tom - Kolarovo v., Yar v., Kurlek v.; Bat - Baturino v.; BYr - Beliy Yar v., Pod - Podgornoye v.; Teg - Teguldet v.; Kol -Kolpashevo v.; Par - M. Nesterovo v.; Kar - Kargasok v., Novoyugino v., B. Griva; Str - Strezhevoy t.] При изучении взаимосвязи числа ОИ со значением ЭИ было условно выделено три группы местообитаний: 1) правый берег Оби - на р. Томь, р. Чулым, р. Кеть, в которых ЭИ находилась в диапазоне 2,7-3,9% (г. Томск, с. Коларово, с. Яр, Курлек, с. Тегульдет, с. Батурино, с. Белый Яр, г. Колпашево); 2) левый берег Оби севернее 57°47' с.ш. - на р. Чая, р. Парабель и р. Васюган, в которых ЭИ составляла менее 2% (с. Подгорное, с. Каргасок, с. М. Нестерово, г. Стрежевой, с. Кривошеино); 3) берег Оби южнее 57°47' с.ш., где инвазия не была обнаружена (Бакчарский, Ше-гарский, Первомайский и Молчановский районы). Исследована динамика СЭТ за последние 45 лет с 1976 по 2020 г. (четыре цикла Швабе) в трех населенных пунктах - г. Томске, г. Колпашеве и 140 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий г. Стрежевом, расположенных друг от друга на расстоянии примерно двух широтных градусов (табл. 3). Таблица 3 [Table 3] Суммы эффективных температур (СЭТ) и оборотов инвазии (ОИ) для трех населенных пунктов в Томской области за 45 лет наблюдений [The Sum of effective temperatures (SET) and the number of invasion circles (CI) for three localities in Tomsk oblast for 45 years] Населенный пункт (широта) [Locality name (latitude)] Минимальные СЭТ (ОИ) [Minimal SET (CI)] Максимальные СЭТ (ОИ) [Maximal SET (CI)] Амплиту да СЭТ (ОИ) [Amplitude of SET (CI)] Приращение СЭТ на сезон [Increment of SET per season] Среднее СЭТ (ОИ) [The average SET (CI)] г. Томск [Tomsk c.] (56°29' N) 224 (1,72) 543 (4,18) 319 (2,46) 1,6 360,2 (2,77) г. Колпашево [Kolpashevo t.] (58°21' N) 173 (1,33) 514 (3,95) 341 (2,62) 0,7 319,5 (2,46) г. Стрежевой [Strezhevoy t.] (60°44' N) 114 (0,88) 502 (3,86) 388 (2,98) 1,5 289,6 (2,23) Изменение показателя на один широтный градус [Parameter change for one latitude degree] 25,9 (0,2) 9,6 (0,07) 16,2 (0,12) - 16,6 (0,13) Минимальные, максимальные и средние значения СЭТ уменьшались с юга на север, а амплитуда колебаний СЭТ - с севера на юг. Среднее приращение СЭТ за один сезон в течение сорокапятилетнего периода изменялось от 0,7 °С в г. Колпашево до 1,6 °С в г. Томске (см. табл. 3). Таким образом, динамика потепления в крайней южной и северной точке наблюдения была почти одинаковой, а в г. Колпашево, расположенном между ними, оказалась меньше почти в два раза. Наиболее теплые сезоны выпали на последнее десятилетие (2012 и 2016 гг.), а в г. Томске сезон 2020 г. оказался четвертым среди максимальных показателей СЭТ за всю историю наблюдений. Обсуждение Широкое распространение инвазии в популяциях малярийных комаров Томской обл. позволяет заключить, что дирофиляриоз в этом регионе покидает категорию редких гельминтозов. Согласно критериям, описанным в литературе [6], отдельные населенные пункты могут быть отнесены к зоне умеренного риска, где ЭИ составляет 5-10%. Передача паразита подтверждена находками микрофилярий в хоботке комаров вплоть до 59° с.ш. В условиях нарастающего потепления в Томском Приобье дирофиляриоз может перейти в разряд постоянно регистрируемых гельминтозов человека уже в ближайшие несколько лет, как это сейчас происходит в Омском Прииртышье [15]. 141 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics В Томской области насчитывается 581 населенный пункт, шесть из которых - города областного или районного подчинения. В ходе работы обследовано 6,2% населенных пунктов, где проживает около 80% населения области, в большей половине из них (58,3%) обнаружены переносящие дирофилярий малярийные комары. Если учитывать наши исследования на немалярийных комарах 2017-2020 гг. [29], то вывод о возрастании риска заражения человека дирофиляриозом можно считать вполне обоснованным. При этом малярийные комары оказываются чаще зараженными 2,1±0,17%, чем немалярийные 1,4±0,21% (%2 = 8,615; df = 1; p < 0,01), что говорит об их преимущественной роли в переносе дирофилярий в Томском Приобье. Наиболее надежный индикатор передачи дирофилярий - доля самок с микрофиляриями инвазивной стадии L3 (векторная эффективность). Совокупная зараженность сообщества комаров (векторная компетентность) менее информативна, поскольку в ходе развития микрофилярий часть самок промежуточного хозяина погибает, не достигнув инфективной фазы, другая часть нейтрализует паразита посредством иммунной системы или про-тективных факторов ассоциированного микробиома [34-37]. Поэтому так важно сопровождать ксеномониторинг визуальной оценкой, не ограничиваясь ПЦР-тестом, определяющим наличие ДНК паразита, но не его физиологическое состояние, возраст и другие особенности заражения. Показатель векторной эффективности в 5,7%, полученный в настоящем исследовании, невелик. Например, для An. stephensi, опасного переносчика дирофилярий на Ближнем Востоке и Африке, векторная эффективность составляет не менее 17% [38]. Однако наличие группы микрофилярий конца L2 - начала L3 объемом 17% в наших исследованиях показывает, что этот параметр варьирует в ходе сезона и нуждается в усредненной оценке. Перепады суточных температур в 20-25 °С, а также периоды похолоданий или засухи, типичные для сибирского климата, вынуждают дирофилярий развиться с перерывами [34], что делает оценку векторной эффективности адекватной только в дни созревания во второй половине лета (после спада численности немалярийных комаров) и может искажать реальную картину циркуляции инвазии в другие периоды. На обоих берегах Оби показатель ЭИ малярийных комаров проявлял тенденцию к увеличению с юга на север в поясе 56-59° с.ш., однако на правом берегу ЭИ оказалась почти в 3 раза выше (см. рис. 2). Такое распределение инвазии выглядит необычным с позиций общепринятых представлений об экспансии паразита, продвигающегося с юго-запада на северо-восток. Правый берег Оби значительно более заселен - на нем расположены пять из шести городов области. По левому берегу вдоль Оби проходит транспортная магистраль, соединяющая районные центры юга и севера области, включая г. Колпашево. Плотность населенных пунктов вдоль трассы высока, тогда как на правом берегу населенные пункты сильнее изолированы а транспортный поток намного слабее. Исходя из этого, завоз больных собак [4] вряд ли можно считать основным способом миграции 142 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий паразита. Расселение дирофилярий могло проходить вдоль притоков Оби на правом (р. Кеть, р. Чулым р. Томь) и левом (р. Чая, р. Парабель, р. Ва-сюган) берегах, в зонах повышенной влажности. Экспансия дирофилярий во многом обусловлена потеплением климата. Анализ многолетнего распределения СЭТ в трех городах Томской обл. (см. табл. 3) показал его неравномерный характер при нарастании количества тепла за сезон на 0,7-1,6 °С. Среднесезонная СЭТ за цикл Швабе в Томске увеличилась с 328 °С/сезон (2,52 ОИ) в 1976-1985 гг. до 377 °С/сезон (2,9 ОИ) в 2009-2019 гг., или на 13%. Для Колпашева аналогичный показатель - 2%, для Стрежевого - 16%, что говорит о значительно более стабильном климате Колпашева. Построение модели с учетом дискретного характера созревания микрофилярий показало сезонное чередование скорости развития с пиками в 22 и 28 суток [34]. Такая динамика наилучшим образом способствует их адаптации в условиях влажного континентального климата. Согласно расчетам, потепление в местобитаниях происходит неравномерно, что связано не только с широтой, но и с локальными факторами (см. табл. 3), такими как влажность. Высокая влажность способствует высокой численности комаров на протяжении всего сезона [39]. Заболоченные территории формируют особый микроклимат [40], смягчающий перепады суточных температур и влияющий на развитие микрофилярий в промежуточных хозяевах. В эндемичных регионах с устоявшимися гельминто-гостальными отношениями An. maculipennis s.l. выделяют в качестве первостепенного переносчика наряду с Ae. caspius, Ae. vexans, Cx. pipiens s.s. [17, 19, 41, 42]. В связи со сложностью различения видов-двойников, входящих в подгруппу Maculipennis, их редко определяют до вида и отмечают как An. maculipennis s.l. Тем не менее показано, что в южной Европе (Португалия, Испания) и Иране переносчиком дирофилярий выступают An. atroparvus и An. maculipennis s.s., в южной и средней Европе - An. messeae и An. daciae [24-27]. В Томской обл. три вида малярийных комаров подгруппы способны переносить дирофилярий, но An. beklemishevi примерно вдвое менее активен, в то время как способность к переносу An. daciae и An. messeae варьирует в местообитаниях, возможно, в зависимости от антропогенной нагрузки или особенностей биотопов (см. табл. 2). О векторной эффективности остальных представителей подгруппы ничего не известно. Поэтому в ходе ксеномониторинга важно проводить определение комаров до вида или глубже (подвид, хромосомная раса). An. daciae - инвазивный для Томского Приобья вид, за последние 50 лет наблюдений практически полностью вытеснивший An. messeae и An. beklemishevi в окрестностях г. Томска вследствие глобального потепления климата [44, 45]. Южнее 57-й параллели этот вид заражен, как правило, D. repens, но в окрестностях г. Колпашева An. daciae переносил D. immitis наряду с An. messeae и An. beklemishevi. Между 57-й и 58-й параллелями доминировал An. messeae, севернее -An. beklemishevi [46] (см. табл. 2). An. daciae занимал третью позицию со-143 Клеточная биология и генетика / Cell Biology & Genetics гласно индексу доминирования (около 15%), но его зараженность в среднем соответствовала An. messeae. ЭИ An. beklemishevi была сравнительно высокой только в местообитаниях, где другие виды малярийных комаров присутствовали в небольшой доле (с. Белый Яр и с. Клюквинка). Пониженную заражаемость An. beklemishevi в условиях симпатрии сложно объяснить. Причиной могут служить экзофильность, раннелетний характер развития, невысокая привлекательность собак как прокормителя, а также специфический микробиом [37]. Практически все зарегистрированные случаи дирофиляриоза человека в России являются подкожной или глазной формами, тогда как легочный дирофиляриоз встречается крайне редко [47]. Собаки европейской части РФ на 60-80% заражены D. immitis [7, 48, 49], но в образцах крови собак Омска и Томска обнаруживалась только D. repens [15, 51]. Малярийные комары европейской части России и Западной Сибири переносили преимущественно D. repens [15, 51, 52]. Более 90% обнаруженных нами дирофилярий в малярийных комарах также отнесены к D. repens. При этом в мире основным переносчиком D. immitis считаются малярийные комары [21]. Вид D. immitis в Томске выявлен нами впервые с помощью ПЦР-анализа у Ae. cantans 4,7% от общего числа инвазированных самок [29], а в настоящей работе обнаружен у An. beklemishevi, An. messeae и An. daciae Копашев-ской агломерации в объеме 13,6% зараженных особей (см. табл. 3). D. immitis мультигостальна и распространена в Евразии, Южной и Северной Америке и Австралии [8]. Легочные дирофилярии более требовательны к теплу и влажности, чем подкожные, в связи с чем медленнее продвигаются на север [9]. Обнаружение этого вида с такой частотой в Колпашевской агломерации может указывать на зарождение очага. Проблема смешанной и повторной инвазии интересна с позиций взаимодействия разных возрастных групп видов паразита между собой и с организмом хозяина, поскольку стратегии манипуляций инвазивных и неинвазивных стадий часто противоречат друг другу [53]. Наблюдаемая нами картина суперинвазии (см. рис. 3) позволяет сделать следующие заключения: 1) повторное заражение у малярийных комаров происходит довольно часто (6,7% в 2020 г.); 2) оно происходит через 1-3 гонотрофических цикла, о чем можно судить по разнице в возрасте микрофилярий; 3) микрофилярии не препятствуют вторичному нападению промежуточного хозяина на зараженное животное; 4) микрофиляриемия дефинитивного хозяина не препятствует повторному заражению малярийных комаров; 5) собаки - один из предпочтительных объектов нападения для малярийных комаров. Следует заметить, что микрофиляриемия собак повышает их привлекательность для комаров рр. Culex и Coquillettidia [54, 55]. В отношении видов комаров других родов эта тема остается открытой. 144 Фёдорова В. С., Бурлак В. А., Артемов Г.Н. Распространение дирофилярий Выводы 1. Дирофилярии широко распространены в Томской области. Северная граница распространения Dirofilaria repens - 60°44' с.ш., а D. immitis - 58°32' с.ш. Северная граница передачи D. repens расположена около 59° с.ш. 2. Вклад малярийных комаров в циркуляцию и распространение дирофи-ляриоза в Томской области не меньше, чем других кровососущих комаров. 3. Три вида малярийных комаров являются переносчиками Dirofilaria repens и D. immitis. Anopheles beklemishevi реже заражается микрофилярия-ми по сравнению с An. messeae и An. daciae. 4. Уровень заражения природных популяций малярийных комаров дирофиляриями значимо выше на правом берегу р. Оби по сравнению с левым берегом. 5. Микстовые инвазии и суперинвазии малярийных комаров дирофиляриями нередко встречаются в Томской области. Благодарности: авторы выражают благодарность аспирантам Евгении Соболевой, Химене Калдерон и Светлане Алексеевой за помощь в обработке материала и проведении анализов.

Скачать электронную версию публикации