Comparative analysis of molecular composition of pericentromeric heterochromatinof polytene chromosomes of malarial mosquitos Anopheles (Culicidae, Diptera) .pdf Исследования в области проблемы пространственной организации клеточного ядра проводятся уже более ста лет. В 60-х гг. прошлого столетия были сформулированы основные принципы организации хроматина в интерфазном ядре [2]. В настоящее время остается актуальным вопрос распределения генетического материала в пространстве ядра, особенно в период интерфазы, когда в клеточном ядре происходит ряд событий, в которых ориентация хромосом играет немаловажную роль. Неслучайное распределение хроматина в ядре связано с надхромосомными механизмами регуляции генетической экспрессии [3, 4].Ранее было показано, что пространственная организация хромосом в ядрах слюнных желез и мальпигиевых сосудов малярийных комаров отличается от таковой в трофоцитах яичников, а также, что архитектура хромосом в ядрах клеток генеративной ткани двукрылых может различаться даже у филогенетически близких видов [5]. Это говорит об эволюционном значении организации хромосом в пространстве клеточного ядра.Известно, что топологические особенности организации хроматина в ядре основаны на взаимодействии хроматина с белками внутриядерного матрикса и ядерной оболочки. Очевидно, что эти контакты обеспечиваются специфическими последовательностями ДНК, которые опосредованно через белки определяют архитектуру хромосом во внутриядерном пространстве. Поскольку в местах контактов хромосом с ядерной оболочкой были обнаружены гетерохроматиновые блоки, можно говорить о том, что связи гетерохроматина с ядерной оболочкой являются основой для пространственного упорядочения отдельных хромосом и интерфазного ядра в целом [6-10]. Гетерохроматин ассоциирует в себе ряд различных последовательностей ДНК и является источником их изменчивости, что предусматривает его важную роль в эволюции эукариот [11]. В настоящее время известно, что гетерохроматин является не менее важной частью генома, чем эухроматин. Изменения, относящиеся к его составу, количеству, структуре и распределению, характеризуют гетерохрома-тин как фактор, сопутствующий видообразованию [5, 11, 12].Несмотря на успешное изучение различных механизмов работы гетеро-хроматина, таких как эффект положения или механизм его компактизации [13-15], остается еще ряд нерешенных вопросов. Например, вопрос о характере влияния изменений прицентромерного гетерохроматина (ПГ) на пространственную структуру интерфазного ядраУдобным объектом для решения подобных вопросов является ПГ политенных хромосом малярийных комаров рода Anopheles комплекса maculipennis. Род Anopheles включает большое разнообразие видов, которые имеют широкий ареал распространения, исключающий зоны пустынь и крайних широт. Изучение архитектоники политенных хромосом в ядрах тро-фоцитов яичников 8 видов комаров комплекса «Anopheles maculipennis» показало, что существуют межвидовые различия прикрепления хромосом к оболочке клеточного ядра. Хромосомы этих видов имеют четкие различия по наличию/отсутствию облигатного прикрепления к ядерной оболочке, по морфологии участков прикрепления и по расположению области прикрепления на оболочке ядра [5, 16-18]. В популяциях малярийного комара Anopheles наблюдаются изменения размеров а-гетерохроматиновых блоков [13, 15, 18-20], что, возможно, связано с его адаптивным значением, Р-гетеро-хроматин участвует как в межхромосомных взаимодействиях (образование хромоцентров), так и в контактах с ядерной оболочкой [8].Представляет интерес исследование структурных особенностей участков прикрепления хромосом к ядерной оболочке некоторых видов комплекса «Anopheles maculipennis»: An. atroparvus, An. messeae и An. beklemishevi. Архитектура политенных хромосом в трофоцитах яичников этих видов на цитогене-тическом уровне к настоящему времени уже хорошо изучена. Ранее при помощи метода микродиссекции политенных хромосом трофоцитов яичников с последующей амплификацией и мечением был получен зонд Atr2R из ДНК ПГ хромосомы 2R, не имеющий жесткого прикрепления к оболочке ядра (рис. 1, а), для сравнительной in situ гибридизации проведенной на данных видах [1]. Было выявлено наличие консервативных и гомологичных последовательностей ДНК во всех районах ПГ исследуемых видов, кроме ПГ хромосомы 2L An. Beklemishevi (рис. 2, б) [1]. Так как этот участок имеет жесткое прикрепление к оболочке ядра, интересным будет дальнейшее изучение структуры ДНК участков прикрепления к оболочке ядра политенных хромосом видов An.atroparvus, An. messeae и An. beklemishevi.Материал и методикаВ работе использовали взрослых самок малярийных комаров трех видов: An. beklemishevi, An. messeae и An. atroparvus. Выделяли яичники и фиксировали в этанол-уксусной смеси (3:1). Для приготовления суховоздушных препаратов политенных хромосом трофоциты яичников давили в 50%-ной про-пионовой кислоте, вымораживали в жидком азоте с последующим обезвоживанием в батарее спиртов (50-70-96%) и еще раз фиксировали в этанол-уксусной смеси (3:1) [22, 23]. Фрагменты ДНК из района прикрепления хромосомы 2L An. beklemishevi и хромосомы XL An. messeae получали методом микродиссекции хромосом сухих препаратов с проведением DOP ПЦР в присутствии протеиназы К. Метод адаптировали для политенных хромосом [23]. Для получения ДНК-зонда проводили дигоксигенирование ДНК (Digocsy-genin «Sigma», США), гибридизацию и детекцию (Anty-Digocsygenin-Rho-damin «Sigma», США) по рекомендованному протоколу [23]. Хромосомы окрашивали DAPI и заключали в DABCO antifade solution («Sigma», США).Для проведения указанных исследований использовали микроскоп AXIOVERT 10, оснащенный микроманипулятором IR (Zeiss) и механическим позиционером, и флуоресцентный микроскоп AXIOSCOP 2; регистрировали сигнал при помощи CCD-камеры (Германия).Меченые районы хромосом идентифицировали по картам политенных хромосом слюнных желёз видов An. atroparvus [24], An. messeae [25] и An. beklemishevi [26, 27].Результаты и обсуждениеНа первом этапе исследования провели микродиссекцию прицентромер-ного участка 15d хромосомы 2L An. beklemishevi (см. рис. 1, б) имеющего жесткое прикрепление к ядерной оболочке. Далее провели in situ гибридизацию полученной районоспецифичной ДНК-пробы (Abekl2L) на политенные хромосомы из трофоцитов яичников видов An. atroparvus, An. messeae, An. beklemishevi. Особенности хромосомной локализации районоспецифичной ДНК-пробы (Abekl2L) из ПГ хромосомы 2L An. beklemishevi на политенных хромосомах An. atroparvus, An. messeae и An. beklemishevi оценивали в сравнении с результатами гибридизации районоспецифичной пробы Atr2R.In situ гибридизация районоспецифичной пробы прицентромерного района хромосомы 2L An. beklemishevi на хромосомы питающих клеток яичников An. beklemishevi, An. messeae, An. atroparvus показала следующие результаты.У An. beklemishevi зонд гибридизовался в небольшом участке проксимальной области прицентромерного района 5ab хромосомы XL (рис. 3, а). В хромосоме 2L метка Abekl2L включилась в область прикрепления к оболочке ядра(район 15d, из которого была взята проба), при этом видны ярко светящиеся тяжи (см. рис. 2, а; 3, а). В прицентромерном участке хромосомы 2R, район 14с, также можно наблюдать меченые тяжи ДНК прикрепления к ядерной оболочке, но менее яркие, чем у смежного участка хромосомы 2L. Хромосома 2L An. messeae пометалась в прицентромерном районе 15d, а также в районе 12b хромосомы 2R (рис. 3, б). В хромосоме 3R гомологичные пробе последовательности локализованы в районе 32cd. В хромосоме 3L выявлено два участка мечения в районе расхождения гомологов 33c, разделенных участком, где сигнал отсутствует (см. рис. 3, а). В то же время, метка отсутствовала на прицен-тромерных участках с а-гетерохроматином хромосомы 3R An. beklemishevi.Ранее в работе с фрагментом ПГ 2R An. atroparvus [1] у An. beklemishevi локализация меченого зонда в районе 5ab хромосомы XL не была определена [1]. Не было обнаружено и локализации флуоресцентной метки на хромосоме 2L (см. рис 2, б), но в участках прикрепления хромосомы 2R мечение имело место с характерными тяжами прикрепления к ядерной оболочке. Хромосома 3 была тоже помечена, но гомологичные последовательности были включены как в блочный а- и Р-гетерохроматин [1].У An. messeae проба обнаружена в ПГ хромосомы XL и в районе 5ab (рис. 3, б). Хромосома 2L An. messeae пометилась в прицентромерном районе 15d (мечение наблюдается только в районе Р-гетерохроматина), а также в районе 12b хромосомы 2R (см. рис. 3, б). Хромосома 3R отмечена локальным сигналом в прицентромерной области, район 32cd, и более диффузно - в хромосоме 3L, район 33c (рис. 3, б). Отсутствие метки наблюдается на участках с а-гетерохроматином прицентромерого участка и в других районах хромосомы 3R.Ранее при гибридизации ДНК-зонда Atr2R с политенными хромосомами An. messeae также наблюдалось мечение ПГ хромосомы XL. Хромосома 2 обнаруживала сигнал в районах и а- и Р-гетерохроматин прицентромерного района обоих плеч, а уровень сигнала был высоким. Гомологичные последовательности были обнаружены в блочном а- и Р-гетерохроматине хромосомы 3 [1].У An. atroparvus также обнаружены последовательности, гомологичные ДНК-последовательностям ПГ XL-плеча половой хромосомы, локализованные в районе 5ab (см. рис. 3, в), который у данного вида в трофоцитах яичников всегда прикреплён к ядерной оболочке. На хромосоме 2 сигнал расположен в прицентромерном районе обоих плеч - 15d плеча 2L (помечен только Р-гетерохроматин) и 14c плеча 2R, но в правом плече наблюдается менее интенсивное свечение метки (рис. 3, в). У An. atroparvus помечен как и у двух предыдущих видов ПГ хромосомы 3: только районы 32a-c и 33cd (рис. 3, в).В работе с районспецифичной пробой Atr2R [1] наблюдалось мечение ПГ хромосомы района XL интеркалярного гетерохроматина 2b. У An. atroparvus был помечен и а- и Р-гетерохроматин прицентромерного района обоих плеч второй хромосомы, как и у An. messea. Уровень сигнала на хромосоме 2 был высоким [1]. ПГ хромосмы 3 тоже включал в свой состав гомологичные пробе Atr2R последовательности, заключенные в блочном а- и Р-гетерохро-матине [1].Таким образом, в ранее проведенных исследованиях с ДНК-пробой Atr2R гомология обнаруживалась со всеми хромосомами независимо от их отношения к ядерной оболочке. Причем левое плечо хромосомы 2 An. beklemishevi, которое облигатно крепится к оболочке ядра, оказалось непомеченным. Не обнаружил сигнала также район прикрепления XL хромосомы An. messeae.В наших исследованиях с ДНК-зондом у Abekl2L An. beklemishevi и An. atroparvus зонд гибридизовался во все прицентромерные районы, у An. messeae - в прицентромерные участки всех хромосом, а также в интерка-лярный район хромосомы 2. Но сигнал отсутствовал в блоках прицентромер-ного а-гетерохроматина хромосом 2 и 3. Район прикрепления XL снова не обнаружил гомологии с изучаемым зондом Abekl2L (см. рис. 3б).Слабая гомология ДНК районспецифичной пробы из прицентромерного участка хромосомы 2 An. atroparvus и пробы из ПГ левого плеча хромосомы 2 An. beklemishevi с районом прикрепления XL хромосомы к оболочке ядра An. messeae говорит о наличии в этом районе состава ДНК ПГ отличного от такового в исследуемых зондах Atr2R и Abekl2L.Вторым этапом с помощью метода микродиссекции выделили ДНК района прикрепления хромосомы XL (рис. 4). Провели сравнительную in situ гибридизацию на хромосомы этого же вида и получили следующие результаты: оказались помеченными прицентромерные области всех хромосом, кроме того, гомология была обнаружена с множеством интеркалярных районов хромосомы 2 и хромосомы 3. Блоки а-гетерохроматина также обнаруживали метку.Выявлены следующие различия прикрепления хромосомы 2 у трех изучаемых видов: у An. beklemishevi хромосома 2 в области прицентромерного гетерохроматина образует облигатный контакт с оболочкой ядра, у An. messeae она вообще не образует контактов с ядерной оболочкой, а у An. atroparvus обнаруживается внутривидовая изменчивость морфологии данного района с образованием факультативных связей хромосома - ядерная оболочка, расположение хромосом в ядре и их взаимоотношение с ядерной оболочкой не определяется универсальными последовательностями, так как не все области прикрепления имеют одинаковую элементарную структуруПри анализе состава ДНК в исследованиях с ДНК-пробой Atr2R была обнаружена гомология последовательностей двух фрагментов с участками некоторых генов (Atr2R-6, Atr2R-71a и Atr2R-107), мобильными элементами типа gypsy (Atr2R-50a и Atr2R-53) An. gambiae и D. melanogaster. Но основную часть прицентромерного района хромосомы 2 An. atroparvus составляют АТ-богатые повторы, различающиеся как по последовательности, так и по копийности в геноме этого вида. Причем коротких тандемных повторов почти не было обнаружено; единственный тандемный повтор длиной 45 пн. был найден только в одном из фрагментов. С помощью Саузерн-блот гибридизации такие повторы были обнаружены и у An. messeae. Большинство повторов изучаемых фрагментов, как показал анализ, проявляют гомологию с первичной последовательностью An. messeae, хотя разница в интенсивности сигналов свидетельствует о количественном различии этих повторов.Исследование ДНК-зонда Abekl2L содержит АТ-богатую ДНК низкой сложности, только в одном фрагменте обнаружены тандемные повторы, найдено несколько фрагментов гомологичных LINE-элементам, характерным для млекопитающих, что говорит о консервативности данного района. Анализ обеих проб Abekl2L и Atr2R на гомологию состава первичных последовательностей ДНК выявил всего одну пару гомологчных клонов - Abekl2L-135 и Atr2R-133 соответственно [E-valu:1.6e-64; Smiht-Waterman score: 929; 93,868% identity (94,313% ungapped) in 212 nt overlap (217-7:158-369)]. Такие результаты говорят, что данная проба является более специфичной, нежели проба Atr2R из ПГ хромосомы 2R An. atroparvus.По данным ранее проведенных исследований, ДНК 80% района ПГ хромосомы 2R An. atroparvus составляют последовательности обладающими характеристиками различных классов ДНК ядерного матрикса. Наиболее представлен класс ДНК синаптонемного комплекса, однако выявляются и ДНК ядерной ламины. Несмотря на отсутствие прочного крепления изучаемого района прицентромерного гетерохроматина к оболочке ядра в трофоцитах яичников у An. atroparvus, в его составе присутствуют ДНК с необходимыми свойствами. Следовательно, одного наличия подобных последовательностейДНК ещё недостаточно для формирования прочной связи хромосомы с ядерной оболочкой.Таким образом, расположение хромосом в ядре и их взаимоотношения с ядерной оболочкой не определяются универсальными последовательностями, т. к. не все области прикрепления имеют одинаковую элементарную структуру. В то же время нельзя утверждать, что свойство прикрепления хромосом к оболочке может зависеть от специфических повторов характерных для отдельно взятой хромосомы. Вероятно, пространственную организацию хромосом в ядре определяют композиции повторенных последовательностей, специфичных для каждого участка прикрепления.Работа выполнена при финансовой поддержке: РФФИ (проект № 06-0496965, № 07-04-01484, № 07-04-12185), целевой программы«Развитие научного потенциала высшей школы (2006-2008 гг.)» (проект РНП.2.2.1.1.2038) и проекта ФЦП № 2007-2-1.2-06-03-019.Литература

Скачать электронную версию публикации