Antagonistic effect on phytopatogenic fungi and stimulation influence on growth and development of plantsby bacteria Pseudomonas sp. B-6798 utilizing formaldehyde .pdf В связи с биологизацией и экологизацией сельскохозяйственного производства направление по созданию биопрепаратов для защиты растений становится все более актуальным [1-4]. Существует множество биологических функций микроорганизмов, направленных на осуществление биосинтеза метаболитов различного действия. Потенциальным объектом агробиотехнологии являются ризосферные PGPR (от Plant Growth-Promotion Rhizobacteria), широко используемые для разработки биологических средств защиты растений от фитопатоге-нов, а также биопрепаратов, стимулирующих рост и повышающих продуктивность растений. Механизм действия этих микроорганизмов на фитопатогены включает конкуренцию за источник питания, эффективную колонизацию ризосферы, синтез антибиотических и рострегулирующих веществ [2-4]. Над расширением ассортимента микробиологических препаратов, изысканием путей их совершенствования работают многие биотехнологические центры России [5].Среди ризосферных бактерий особое место занимают бактерии рода Pseudomonas. О перспективах их практического применения можно судить по списку уже разработанных биопрепаратов («BlightBan A506», «BioSave», «Blue-Circle», «Intersept», «Victus», «Планриз», «Агат-25», «Псевдобактерин-2»), проявляющих высокую антагонистическую активность по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям, а также способность к стимуляции роста сельскохозяйственных культур [3, 6].Несмотря на все видимые преимущества, применение биологических средств защиты растений сдерживается их достаточно высокой стоимостью при учете нестабильности положительных эффектов, которая складывается из стоимости углеводсодержащих питательных сред и затрат на мероприятияштаммами и параметров роста растений вычислялись с использованием нелинейного регрессионного анализа [14].Результаты и обсуждениеКинетика ингибирования роста фитопатогенных грибов ризосферными бактериями in vitro. Фунгистатическая активность является достаточно распространенным признаком среди бактерий различных таксономических групп. Антифунгальная способность дает экологическое преимущество бактериальной популяции, которая конкурирует с микроскопическими грибами в специфической среде обитания. Практическое значение эта бактериальная черта нашла как в медицине, так и в сельском хозяйстве, где бактерии, обладающие антифунгальной активностью, широко используют в борьбе с различными почвенными фитопатогенными грибами (агенты защиты растений) [3]. Антифунгальная активность бактерий, обнаруженная in vitro, как правило, положительно коррелирует с их способностью ингибировать рост фито-патогенов in vivo [15], поэтому лабораторные эксперименты - это неотъемлемая часть и эффективный способ изучения взаимоотношений почвенных грибов с ризосферными бактериями. Однако большинство известных методик позволяет лишь оценить присутствие фунгистатического эффекта, не давая четкого представления о его степени [16].Нами была предложена и апробирована методика, позволяющая численно оценить эффект подавления роста грибных колоний бактериями на твердых питательных средах в чашках Петри. В ходе экспериментов каждые 24 ч проводили измерение диаметра грибных колоний, образующихся на агаризован-ных питательных средах с различными концентрациями бактерий в инокуля-те при стандартизованной процедуре инокуляции. На рис. 1 на примере гриба Fusarium oxysporum var. lini на среде с Pseudomonas sp. В-6798 показано увеличение диаметров колоний с течением времени.Известно, что рост филоментозных организмов, т. е. увеличение их биомассы, не подчиняется экспоненциальному закону. Зависимость роста гифов грибов от времени линейна [11]. В наших экспериментах рост колоний грибов является линейным как в чашках с ложным высевом, так и в присутствии бактерий в различных концентрациях, причем с увеличением концентрации происходит замедление роста гриба, которое отражается в уменьшении наклона прямых.За количественную оценку скорости роста гриба брали тангенс угла наклона прямых, отражающих изменение диаметра колоний с течением времени. Анализ полученных данных показал, что скорость роста грибных колоний с увеличением концентраций бактерий в чашках Петри стремится к предельному значению, не равному нулю, т. е. не наблюдается полного абсолютного ингибирования роста грибов бактериями изучаемых штаммов. В рассмотренных моделях взаимодействия грибов с бактериями достаточно концентрации 107-108 кл/мл для достижения предельного значения скорости роста грибов.06020140Согласно литературным данным, эффект ингибирования роста грибов бактериями рода Pseudomonas связан прежде всего с выделением псевдомонадами различных антибиотиков и сидерофор (желто-зеленый пигмент, осуществляющий транспорт железа) [2, 4, 19]. Известно, что бактерии Pseudomonas sp. В-6798 синтезирует желто-зеленый пигмент [7], а эффект ингибирования роста грибных колоний уменьшается добавлением в среду соединений трехвалентного железа [10], поэтому нам представляется, что в эффекте ингибирования наибольшую роль занимает сидерофорный механизм.Для описания кинетики ингибирования роста грибных колоний исследуемыми бактериями нами было использовано модифицированное уравнение Н.Д. Иерусалимского [17]:где V(C) - скорость увеличения диаметра колоний фитопатогенных грибов (мм/ч); Voo - остаточная скорость роста гриба при «бесконечной» концентрации бактерий (мм/ч); Vmax - кинетический параметр, отражающий скорость роста гифов в отсутствии бактерий и в сумме с Vo, численно равный максимальной скорости роста данного гриба (мм/ч); Ki - константа ингибирования, численно равная концентрации бактерий, при которой достигается половина от максимального эффекта ингибирования (кл/мл); n - коэффициент нелинейности ингибирования; С - концентрация клеток бактерий в инокулюме (кл/мл).0,00050,05005,0000 500,0000 50000,0000 5E6I0,5000 50,0000 5000,0000 5E5 5E75E85E9Концентрация бактериальных клеток в инокуляте, кл./млРис. 2. Зависимость скорости роста колоний гриба Fusarium oxysporum var. lini от концентраций бактериальных клеток Pseudomonas sp. B-6798О силе антифунгального действия бактерий можно также судить по остаточной скорости роста колоний гриба (V»). Анализируя этот параметр, можно судить о том, насколько полно подавляют рост гриба изучаемые виды бактерий. Наибольшее подавление роста грибных колоний бактериями опытного штамма наблюдалось в варианте с F. oxysporum var. gladioli, что иллюстрируют данные табл. 1.Анализ представленных данных показал, что наблюдаются некоторые отличия в реакции грибов на присутствие бактериальных колоний. Наиболее явными они представляются при анализе параметров ингибирования роста колоний грибов разных родов (в нашем случае - грибы родов Fusarium и Bipolaris), хотя в менее отчетливой форме они существуют даже внутри одного вида (рассмотренные разновидности фузариума). Можно предположить, что для изучения параметров ингибирования роста колоний гриба определенного рода недостаточно эксперимента на одном из его видов, константа ингибиро-вания варьирует, по нашим наблюдениям, даже в пределах вида. Однако для оценки присутствия антифунгального эффекта в целом эксперимент на одной разновидности достаточно показателен для всего вида.Влияние бактерий штамма Pseudomonas sp. В-6798 на кинетические параметры роста растений в модельных экспериментах. В литературных источниках широко представлены сведения, описывающие положительное влияние на рост и развитие растений бактерий, отнесенных к ризосферным или тяготеющих к зоне ризосферы [3, 5, 11]. Нами был поставлен ряд экспериментов с использованием метода малых наземных экосистем [11], направленных на изучения влияния Pseudomonas sp. В-6798 на рост и развитие растений пшеницы, овса и кукурузы в лабораторных условиях. В ходе экспериментов каждые 24 часа проводились замеры длины наземной части растений. Данные о росте ггшеницы представлены на рис. 3 на примере изменения длины растений вариантах с инокуляцией бактериями Pseudomonas sp. В-6798 с титром 106 кл/мл.Как известно, рост любого органа, как и самого растения в целом, описывается в виде S-образной (сигмоидальной) кривой Сакса. Из множества количественных моделей роста растений наибольшее распространение получила логистическая функция [18]. Логистическая кривая имеет симметричный характер, т. е. скорость роста на начальном этапе увеличивается так же быстро, как и падает на заключительном этапе развития растения или органа. Если рост на начальном этапе замедлен, то кривая приобретает экспоненциальный вид.2CS Ио о ft оев0к я160Рис. 3. Изменение длины вегетативной части тненицы с течением времениРост растений пшеницы на изучаемой нами стадии (прорастание-фаза выхода третьего листа) соответствует S-образной кривой (см. рис. 3). Для описания данной кривой нами было использовано следующее логистическое уравнение [19]:y(t )■Aert B + x0ert(2)где y соответствует длине проростка с течением времени (мм); t - время (ч); r - скорость удлинения проростка (мм/ч); x0 - «минимальная» длина проростка, соответствующая длине проростка после активации зерна в течении 24 ч (мм); А - константа уравнения, численно соответствующая произведению минимальной длины проростка на максимально возможную в условиях эксперимента (мм): A=Xo*xmax; В - константа уравнения, численно соответствующая разности минимальной длины проростка из максимальной (мм): B= xmax-x0. Рост проростков овса также соответствовал описанному логистическому уравнению.Рост проростков кукурузы соответствовал экспоненциальному закону[19]:L = L0 e'(3)где L - длина вегетативной части растения (мм); L0 - длина проростка кукурузы после активации зерна в течение 24 ч, «минимальная» длина (мм); r -скорость удлинения растения (мм/ч); t - время (ч).зоне ризосферы в этот период максимальна (в дальнейшем возможно их значительное вытеснение из ризосферы аборигенными видами).По нашим данным, при бактеризации псевдомонадами растения быстрее проходят фазы развития, достигая цветения в более короткие сроки, когда удлинение вегетативной части практически прекращается. Так, начало цветения впервые отмечено в варианте с обработкой опытным штаммом псевдо-монаса, а затем в варианте с планризом.Полевые эксперименты, проведенные с растениями овса и кукурузы, показали, что бактеризация семян привела к увеличению параметров развития растений, начиная с фазы проростков; положительное действие бактерий отмечается до окончательного замера длины вегетативной части и сухой биомассы.На основании данных, полученных в фазу полной спелости, нами была вычислена урожайность пшеницы [20].На рис. 6 представлена урожайность пшеницы в различных вариантах полевого эксперимента 2005 г.Хотя параметры развития бактеризованных растений практически не отличаются от контрольного варианта в фазу полной спелости, наблюдается увеличение урожайности пшеницы. На ее увеличение в большей мере оказало влияние увеличение количества зерен в колосе и рост значений массы 1000 зерен.343226242230КонтрольПланризPs.sp. B-6798Рис. 6. Урожайность гтшеницы в различных вариантах полевого эксперимента 2005 г. Звездочкой отмечено статистически значимое отличие р

Скачать электронную версию публикации