EFFECTIVENESS OF STORING SOME BACTERIAL PREPARATIONS IN LIQUID FORM.pdf В сложившихся условиях современного аграрного производства для получения биологически полноценной продукции растениеводства и сохранения плодородия почв необходимо экологически целесообразное хозяйствование. Крупные химические концерны по производству пестицидов во всем мире уже меняют стратегию деятельности. Располагая значительными ресурсами и научным потенциалом, они ориентируются на освоение новых, перспективных направлений, прежде всего в области биотехнологии и генной инженерии [1]. Одним из наиболее динамично развивающихся направлений агро-биотехнологии является создание и применение биопрепаратов комплексного действия на основе микроорганизмов, улучшающих корневое питание растений, стимулирующих их рост, защищающих от болезней и вредителей [2-7]. Особое внимание уделяется изучению микробиологических процессов, протекающих в почве, в ризосфере растений, и использованию ризосферных бактерий в качестве агентов контроля различных заболеваний сельскохозяйственных культур. Таким образом, пестицидный рынок РФ уже имеет целый перечень биопрепаратов и постоянно расширяется.Известно, что наиболее распространенной группой микроорганизмов, являющихся агентами биопрепаратов, направленных на контроль фитопатогенов, являются бактерии рода Pseudomonas. Данная группа микроорганизмов обладает набором свойств, способствующих ускорению роста растений, увеличивающих урожайность сельскохозяйственных культур и защите растений отЭффективность хранения ряда бактериальных препаратов21ряда грибных заболеваний посредством производства антифунгальных метаболитов или путем формирования у растений системной резистентности [8-11].Кроме оценки биологической активности, при создании биопрепаратов большое значение имеют технологичность штамма-агента биопрепарата, товарная форма, срок хранения, сохранность биологической активности и чистоты культуры на протяжении длительного периода времени.На современном рынке представлен ряд препаративных форм: сухая (в основном для препаратов на основе спорообразующих бактерий рода Bacillus), паста или сгущенная биомасса клеток, гели и др. [12-13]. Однако наибольшее распространение получила жидкая форма препаратов, представляющая собой культуральную жидкость с клетками агента установленного титра, без стабилизаторов и консервантов. Такая форма, несмотря на ряд недостатков, заключающихся, прежде всего, в небольшом сроке хранения, неудобстве транспортировки, нестабильности свойств и т.д. [14], наименее тру-до- и энергозатратна, не требует дополнительного оборудования и денежных вложений.Таким образом, целью данной работы являлось изучение динамики биологической активности жидких биопрепаратов на основе ризосферных псевдомонад при их длительном хранении.Объекты и методы исследованияВ экспериментах использовались бактериальные культуры Pseudomonas sp. B-6798, Ps. fluorescens AP-33, Ps. aureofaciens BS 1393.Бактерии Ps. aureofaciens BS 1393 являются агентами биопрепарата «Псевдобактерин-2», получены из музея культур Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН; бактерии Ps. fluorescens AP-33 - агенты биопрепарата «Планриз», разработанного НИИ генетики и цитологии АН Белоруссии; бактерии Pseudomonas sp. ВКПМ штамм В-6798 получены из музея лаборатории биокинетики и биотехнологии НИИ биологии и биофизики Томского государственного университета. Данный штамм непатогенных факультативных метилотрофных псевдомонад способен использовать формальдегид в составе минеральных сред в качестве единственного источника углерода и энергии в концентрации до 267 М (8 г/л) и обладает высокой биологической активностью по отношению к фитопатогенным грибам [15, 16].Для выращивания агентов биопрепаратов использовалась питательная среда и технология, указанная в соответствующем ТУ [17]. Для культивирования формальдегидрезистентных псевдомонад использована минимальная минеральная среда М9 с формальдегидом (фдг) (2 г/л) или глюкозой (гл) (2 г/л) в качестве единственного источника энергетического субстрата, а также среда Кинга В [18-19]. Культивирование осуществлялось в колбах на 250 мл с 50 мл питательной среды на мешалках при температуре 25-27°С. После достижения фазы замедления роста бактериальная культура разливалась в стерильные флаконы на 30 мл из темного стекла. Объем культуры во флаконе составлял % части объема сосуда. Эксперимент был заложен в пяти вариантах. На каждый вариант приходилось по шесть повторностей. Изуче-22Ю.А. Сшшмшпоеа, О.М. Минаева, Е.Е. Акимование динамики численности и биологической эффективности биопрепаратов проводилось каждые 15 сут на протяжении первых 2 мес. хранения и далее каждые 30 дней в течение 4 мес. в 3 повторностях на каждый вариант в одних и тех же флаконах. По истечении 6 мес. хранения исследовались как флаконы, в которых изучалась динамика на протяжении всего эксперимента, так и флаконы, которые хранились закрытыми в течение всего периода времени. Таким образом, невскрытые флаконы служили эталоном, т.к. при их хранении не было опасности заноса контаминантов при заборе проб.В качестве тест-объектов использованы семена пшеницы сорта Новосибир-ская-15, суперэлита, средняя масса семени 0,04 г, общая всхожесть 90-94%.Учет численности биологических агентов и наличия контаминантов осуществлялся методом разведения и высева на плотные питательные среды каждые 15 сут на протяжении первых 2 мес. хранения и далее каждые 30 дней в течение 4 мес. Наличие морфологически отличимых колоний свидетельствовало о присутствии в биопрепарате посторонней микрофлоры или диссоциации бактерий активного штамма. Оценка ростостимулирующей и фунгиста-тической активности биопрепрепаратов проводилась одновременно с учетом бактериальной численности по результатам стандартной фитопатологической экспертизы семян в рулонах фильтровальной бумаги [20]. О наличии биологической активности биопрепаратов заключали по достижению значимости различий с контрольными вариантами, в которых семена обрабатывались водой, и опытными, в которых семена замачивались в рабочих растворах биопрепаратов (1:1000). Для выявления влияния вторичных бактериальных метаболитов на биологическую активность биопрепаратов проводилось осаждение клеток центрифугированием с дальнейшим отмывом от остатка питательной среды в физиологическом растворе (0,85%-ный раствор хлорида натрия) с повторным осаждением.Данные, полученные в ходе экспериментов, обрабатывались с помощью пакета STATISTICA, версия 6.0. Оценка достоверности полученных результатов фитоанализа семян проводилась сравнением выборочных долей с учетом критерия Стьюдента для вероятностей 25-75% включительно, с учетом критерия Фишера для других значений вероятностей [21].Результаты и их обсуждениеОдними из основных показателей качества биопрепаратов являются биологическая эффективность, которая для биофунгицидов оценивается по снижению скорости роста фитопатогенов, способность агентов стимулировать рост и развитие сельскохозяйственных культур, титр активного начала, а также сохранность полезных качеств препарата при его длительном хранении. В ТУ биопрепаратов установлен срок годности в форме суспензионных бактериальных культур на протяжении не более месяца со дня изготовления (Планриз) [17].В лабораторных экспериментах проведена оценка динамики численности агентов ряда биологических препаратов на основе псевдомонад на протяжении 6 мес.Эффективность хранения ряда бактериальных препаратов23На рис. 1 на примере бактерий Pseudomonas sp. B-6798, выращенных на среде Кинга В, представлена динамика численности агентов биопрепарата при его хранении в условиях низких положительных температур (+2...4°С).12,5 г12,0итра11,5н о11,0U-ок10,5евS10,0ниевю9,5§е-S9,0асеL-о8,58,07,50 15 30 45 6090120180Время, сутРис. 1. Динамика численности бактерий Pseudomonas sp. B-6798, выращенных на среде Кинга В, при хранении в суспензионной культуреИзвестно, что для бактерий рода Pseudomonas увеличение бактериального титра может происходить даже при низких положительных температурах, которые были использованы при хранении жидкой суспензии биопрепарата, при наличии энергетического субстрата в культуральной жидкости. Несмотря на то что на хранение были заложены биопрепараты, в которых культивирование было остановлено на фазе замедления роста агента, полученные нами данные о динамике численности бактерий на протяжении первых 15 сут хранения показали, что для бактерий Pseudomonas sp. B-6798 во всех рассмотренных нами вариантах наблюдается остаточный рост бактериальной культуры и титр агента на протяжении данного периода значительно увеличился (рис. 1). Подобная закономерность при этом для бактерий Ps. aureofaciens BS 1393 и Ps. fluorescens AP-33 отмечена не была.Далее на протяжении 6 мес. хранения наблюдается снижение бактериального титра агентов биопрепаратов, однако полной гибели бактерий не происходит. Так, для представленного на рис. 1 варианта эксперимента даже по истечении 6 мес. титр жизнеспособных бактерий оставался на значительно высоком уровне - порядка 10' КОЕ/мл.24Ю.А. Сшшмшпоеа, О.М. Минаева, Е.Е. АкимоваСнижение бактериального титра связано не столько с истощением в среде энергетического субстрата и накоплением продуктов обмена клеток, сколько с ограниченностью запасов кислорода в упаковке биопрепарата. Особенно губительным этот факт оказался для культур, полученных при выращивании на токсичных средах, где кислород выступает основным лимитирующим субстратом для нейтрализации этих веществ путем включения в метаболический путь клеток. Так, для бактерий Pseudomonas sp. В-6798 на среде М9 с формальдегидом в качестве энергетического субстрата отмечена практически полная гибель клеток после второго месяца хранения.На протяжении экспериментов суспензионные культуры большинства биопрепаратов оставались свободными от конгломерантов, посторонняя микрофлора была лишь в незначительном количестве отмечена в варианте с биопрепаратом «Псевдобактерин-2», при этом ее численность оставалась незначительной и не превышала 1% от общего бактериального титра, что вполне допустимо по ТУ. Для формальдегидутилизирующих псевдомонад на среде Кинга В на протяжении учетов было отмечено возникновение «нестандартного» вида колоний: они отличались более крупными размерами с шероховатой поверхностью и неровным краем, в то время как для данного штамма характерны колонии с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем. При проведении теста с бромтимоловым синим и формальдегидом для диссоци-антов отмечено изменение цвета индикатора, указывающего на закисление среды, характерное для метаболизма бактерий Pseudomonas sp. В-6798 при утилизации данного токсичного соединения, и установлено, что данные бактерии не утратили способность к окислению формальдегида до муравьиной кислоты, что подтверждает их штаммовую принадлежность, а не наличие заражения культуры посторонней микрофлорой. Количество данных диссо-циантов после трехмесячного хранения было равным численности основной формы агента.Одновременно с учетом численности бактериальных агентов проводилось определение биологической активности биопрепаратов (определение фунги-статических и ростстимулирующих свойств). Для этого независимо от титра бактериальной суспензии использовалось разведение, рекомендованное для применения биопрепаратов (1:1000).На основании полученных результатов определялась корреляция между параметрами биологической активности биофунгицидов, сроком хранения и численностью агентов препарата в суспензии (табл. 1).Несмотря на значительное падение бактериального титра, биологическая эффективность большинства биопрепаратов, в частности фунгистатическая, не только осталась на высоком уровне, но и продолжала расти на протяжении практически всего срока хранения, о чем свидетельствуют высокие положительные статистически значимые коэффициенты корреляции. Для ряда вариантов эксперимента, при оценке ростстимулирующей активности бактерий, сохранилась аналогичная тенденция. В то время как ростстимулирующая активность биопрепарата на основе бактерий Pseudomonas sp. В-6798, выращенного на среде Кинга В, на протяжении всего срока хранения не изменилась. Кроме того, применение биопрепарата «Планриз» положительно сказа-Эффективность хранения ряда бактериальных препаратов25лось на увеличении длины проростка, но увеличилось и ингибирование всхожести семян, о чём свидетельствует отрицательный коэффициент корреляции.Таблица 1 Коэффициенты корреляции меиоду параметрами биологической активности биопрепаратов, численностью агентов и сроком храненияВариант биопрепаратаСрок храненияЧисленность агентов биопрепарата ЧисленностьФунги-стати-ческая эффективностьВсхожестьДлина проростковФунги-стати-ческая эффективностьВсхожестьДлина проростковПсевдобак-терин-2-0,58*0,89*0,55*0,47*-0,360,03-0,89*Планриз-0,240,70*-0,340,49*-0,280,53*-0,45*Pseudomonas sp. B-6798 на среде М9с фдг-0,41*0,85*0,44*0,51*-0,280,12-0,60*Pseudomonas sp. B-6798 на среде М9сгл-0,290,78*0,77*0,50*-0,44*-0,41*-0,45*Pseudomonas sp. B-6798 на среде Кинга В-0,74*0,83*0,140,04-0,53*0,14-0,10р

Скачать электронную версию публикации