FOR MOTION OF COPPER SULFIDES BY DESULFOVIBRIO SP. R2UNDER OPTIMAL TEMPERATURE CONDITIONS.pdf Сульфатредуцирующие бактерии (СРБ) играют важную роль в осаждениисульфидов металлов в природных экосистемах и технологических схемах [1].Образование сульфидов металлов - основной механизм, посредством которо-го СРБ осаждают тяжелые металлы из раствора [2]. Растворимость сульфидовдвухвалентных металлов низкая и изменяется в пределах 10-4÷10-6 г/100 млрастворителя. Микробное осаждение металлов было продемонстрированоеще в середине прошлого века [3]. Образование ковеллита, сульфида меди,под действием биогенного сероводорода впервые показано Баас-Бекингом иМуром (Baas-Becking and Moore) в 1961 г. [4]. Мак-Нил (McNeil) с соавт.(1991) определил ковеллит и халькоцит (Cu2S) как основную твердую фазусульфидов меди, образующихся биогенным путем [5]. Показано образованиековеллита накопительными культурами, содержащими СРБ [6]. Однако припопытке исследовать образование сульфидов металлов чистыми культурамиСРБ исследователи обычно сталкиваются с проблемой ингибирования ростаклеток при повышенных концентрациях ионов металлов в среде.Многие СРБ чувствительны к повышенным концентрациям ионов двухва-лентной меди. По имеющимся данным, устойчивость к меди большинствапредставителей СРБ рода Desulfovibrio довольно низкая. Для бактерии Desulfovibriodesulfuricans G20 удельная скорость роста уменьшалась при концен-трации ионов меди 0,4 мг/л [7], для других представителей этого рода ростингибировался при 4-9 мг/л ионов меди (II) [8, 9]. Нами впервые описаныштаммы бактерий Desulfovibrio spp., устойчивые к меди (II) в концентрациидо 2600 мг/л [10]. Бактерии Desulfovibrio sp. R2, выделенные из проб сточныхвод предприятия «РОЛТОМ» по производству шарикоподшипников, выдер-живали концентрации ионов двухвалентной меди до 800 мг/л [8].Одним из важных параметров, влияющих на восстановление сульфата ванаэробных осадках [11], а также на скорость сульфатредукции в осадкахветландов, загрязненных металлами, является температура [12]. Кроме того,она оказывает влияние и на продукцию сероводорода СРБ. Описаны случаи,когда оптимальные температуры для роста и дыхания бактерий отличалисьмежду собой, оптимум для дыхания клеток был выше, чем для роста их чис-ленности [13].Целью данной работы являются определение оптимальной температурыроста для устойчивых к ионам меди бактерий Desulfovibrio sp. R2, изучениеобразующихся осадков сульфидов меди современными физико-химическимиметодами в условиях оптимальной температуры.Материалы и методы исследованияВ работе были использовали бактерии штамма Desulfovibrio sp. R2, выде-ленные из проб сточных вод предприятия «РОЛТОМ» и поддерживаемые влаборатории биотехнологии и биоинженерии кафедры физиологии растенийи биотехнологии Биологического института Томского государственного уни-верситета. Культивирование бактерий проводили в анаэробных условиях сиспользованием пресноводной среды Видделя [14] с лактатом в качестве до-нора углерода и электрона. Подробно культивирование устойчивых к медиизолятов СРБ описано нами ранее [8]. Визуальное наблюдение за ростомкультуры проводили путем фазово-контрастного микроскопирования с ис-пользованием исследовательского микроскопа Axio Star (Carl Zeiss).Влияние температуры на рост клеток и образование сероводорода в куль-туре бактерий оценивали по продукции биомассы (концентрации белка) иобразованию сероводорода. Эксперименты по определению концентрациибелка и сероводорода в процессе роста микроорганизма проводили в трехповторностях при температурах в диапазоне от +18 до +38°С. Питательнуюсреду с инокулятом (10%) анаэробно разливали в пенициллиновые флаконы.Концентрацию белка определяли по модифицированному методу Лоури сиспользованием фенольного реактива Фолина [15]. Концентрацию сероводо-рода определяли спектрофотометрически по методике Пахмайера [16]. Кине-тические параметры роста - удельную скорость (μ) и период удвоения куль-туры (Td) - определяли, используя данные о концентрации белка в разныхвременных точках [17]. Данные, полученные в ходе экспериментов, обраба-тывались с помощью пакета Microsoft Office Excel 2003 и представлены вработе в виде средней со стандартным отклонением.Для изучения образования сульфидов бактерии Desulfovibrio sp. R2 куль-тивировали на среде Видделя с добавлением ионов меди в концентрацииОбразование сульфидов меди 21250 мг/л по описанной методике [8]. Выращивание культуры проводили втечение 9 и 58 сут. Образовавшийся после культивирования осадок собиралии концентрировали на центрифуге Eppendorf 5804R (Германия) при 5000об/мин в течение 10 мин. Полученный осадок высушивали на воздухе и из-мельчали до состояния порошка. Порошок исследовали с использованиемсканирующего электронного микроскопа Philips SEM515 (Голландия). Энер-годисперсионный анализ проводили с помощью микроанализатора EDAX.Съемка производилась при ускоряющем напряжении 30 kV, фокусное рас-стояние 12 мм, размер зонда 50-100 нм.Результаты исследования и обсуждениеОпределение оптимальных температур ростаи образования сероводородаИзменение концентрации белка бактерий Desulfovibrio sp. R2 с течениемвремени при различных температурах показано на рис. 1. Кривые роста бак-териальной культуры имели классический S-образный вид. Для каждой тем-пературы культивирования определены продолжительность лаг-фазы, удель-ная скорость роста и период удвоения культуры (таблица).Кинетические параметры роста, выход биомассы и сероводородаDesulfovibrio sp. R2 при разных температурахТ, ºС Лаг-фаза, чУдельная ско-рость роста, ч-1Периодудвоения, чМаксимальнаяпродукция белка,мг/лМаксимальнаяконцентрациясероводорода,мг/л18 23,5 0,067±0,02 10,9 185±40,8 52,9±8,6722 24,5 0,086±0,01 8,24 181±5,27 68,9±3,7528 19,5 0,07±0,01 10,1 217±20,25 66,2±4,832 8 0,29±0,05 2,44 189±13,5 67,2±1,0535 4 0,37±0,15 2,12 184±5,06 56,8±1,2638 10,5 0,21±0,05 3,43 212±6,39 67,2±0,88Наименьшую продолжительность лаг-фазы (4 ч), максимальную скоростьроста (0,37±0,15 ч-1) и наименьший период удвоения (2,12 ч) наблюдали притемпературе культивирования +35ºС. При понижении и повышении темпера-туры продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 23,5 ч при +18ºС и10,5 ч при +38ºС. При снижении температуры с +32 до +28ºС продолжитель-ность лаг-фазы и период удвоения также возрастали.Несмотря на то что максимальная скорость роста бактерий обнаружена притемпературе +35ºС (рис. 2), максимальную концентрацию биомассы наблюдалипри +28ºС, а сероводорода - при +22ºС. В целом, кривые изменения концентра-ции сероводорода в среде с течением времени (см. рис. 3) соответствовали кри-вым роста бактериальной культуры (рис. 1). Следует заметить, что максималь-ные концентрации сероводорода в среде с культурой бактерий в исследованномдиапазоне температур отличались незначительно (от 52,9±8,67 до 68,9±3,75О.22 П. Буторова, А.В. Козлова, А.Л. Герасимчукмг/л). Для дальнейшего изучения образования сульфидов меди бактериями былавыбрана температура культивирования +28ºС, т.к. именно при этой температуреобразуется наибольшее количество биомассы.0501001502002500 10 20 30 40 50 60Время, часКонцентрация белка, мг/л123456Рис. 1. Изменение концентрации белка в культуре бактерий Desulfovibrio sp. R2с течением времени при культивировании в условиях разных температур:1 - 18ºС; 2 - 22ºС; 3 - 32ºС; 4 - 28ºС; 5 - 35ºС; 6 - 38ºС00,050,10,150,20,250,30,350,418 22 28 32 35 38Температура, СУдельная скорость роста, час-1Рис. 2. Зависимость удельной скорости роста бактерий Desulfovibrio sp. R2от температурыВремя, чºСУдельная скорость роста, ч-1Образование сульфидов меди 23010203040506070800 10 20 30 40 50 60время, часКонцентрация сероводорода, мг/л123456Рис. 3. Изменение концентрации сероводорода в культуре бактерий Desulfovibrio sp. R2с течением времени при культивировании в условиях разных температур:1 - 18ºС; 2 - 22ºС; 3 - 32ºС; 4 - 28ºС; 5 - 35ºС; 6 - 38ºСОбразование сульфидов медиИсследование размеров и элементного состава сульфидов меди, образо-ванных бактериями Desulfovibrio sp. R2, проводили с помощью сканирую-щего микроскопа. Обнаружили, что средний размер частиц осадка состав-лял 75 мкм (рис. 4, а) при культивировании бактерий в течение 9 дней, в товремя как при культивировании в течение 58 дней частицы имели болеекрупные размеры, до 300 мкм (рис. 4, в). Частицы осадков, наблюдаемые вконтроле без инокулята, были значительно меньше (рис. 5, а), их среднийразмер составлял около 10 мкм. Энергодисперсионный анализ осадков по-казал, что основными элементами, входящими в состав осадков, образован-ных в среде бактериями штамма R2, являлись медь и сера, как в экспери-ментах с непродолжительным, так и более длительным периодом культиви-рования. Также в полученных спектрах присутствовали железо и в неболь-ших количествах кислород, углерод и фосфор (рис. 4, б, г). Соотношениесодержания в осадке серы и меди составляло 1:1,3 при непродолжительномкультивировании бактерий штамма R2 - 9 сут и 1:1 при культивированииих в течение 58 сут. В контрольном образце основные пики соответствовалимеди и кислороду. Также в контроле присутствовали железо и фосфор, аколичество серы было значительно меньше, и его содержание к меди со-ставляло 1:7,5.Время, ча бв гРис. 4. Микрофотографии и энергодисперсионные спектры осадков сульфидов меди,образованных бактериями Desulfovibrio sp. R2 при культивировании 9 дней (а, б) и 58 дней (в, г)Образование сульфидов меди 25абРис. 5. Микрофотография (а) и энергодисперсионный спектр осадка (б), образованногов контроле без инокулята после 11 дней культивированияУстановлено, что оптимальная температура роста для бактерий штаммаDesulfovibrio sp. R2, устойчивых к повышенным концентрациям меди, со-ставляла +35ºС. При этом максимальное количество микробной биомассыобразовывалось при более низкой температуре, а максимальная концентрациясероводорода во всем исследованном интервале температур изменялась не-значительно. Для экспериментов по изучению образования сульфидов медибыла выбрана температура +28ºС, т.к. именно в этих условиях образовыва-О.26 П. Буторова, А.В. Козлова, А.Л. Герасимчуклась максимальная микробная биомасса. При образовании сульфидов клеткимогут служить сайтами нуклеации будущих кристаллов, поэтому при опти-мизации процесса образования биогенных сульфидов высокая плотность кле-ток в среде имеет большое значение. В случае промышленного примененияпроцесса низкие температуры позволят снизить затраты на обеспечение энер-гией предприятия.Соотношение атомов серы и меди, обнаруженное в биогенном осадке ме-тодом энергодисперсионного анализа, соответствовало минералу ковеллиту схимической формулой CuS. Образование ковеллита было ранее продемонст-рировано в условиях накопительных [6] и чистых культур [10] СРБ. Возмож-но, первоначальное связывание серы с медью происходит в виде дефицитно-го по сере сульфида меди, т.к. соотношение S:Cu увеличивалось при болеепродолжительной инкубации и было близко к 1 после 58 сут культивирова-ния. Вероятной кристаллической фазой на ранних стадиях культивированияможет быть халькоцит (Cu2S).Возможно, в процессе культивирования происходит превращение однойформы сульфида в другую, т.к. известно, что различные формы сульфида ме-ди в зависимости от температурных и других условий могут трансформиро-ваться друг в друга.Известно, что в условиях диагенетического образования сульфидов меди вприродных условиях устанавливается равновесие между процессом образо-вания сероводорода СРБ и переходом S2- в твердую фазу [18]. При повыше-нии концентрации сероводорода начальная форма CuS может сменяться бор-нитом (Cu5FeS4), а затем халькопиритом (СuFeS2). Присутствие на диаграм-мах пиков железа, как при культивировании в течение 9 дней, так и при болеепродолжительном культивировании, свидетельствует в пользу того, что бор-нит и халькопирит могут быть возможными кристаллическими фазами био-генного осадка. Возрастание соотношения S:Cu с увеличением срока инкуба-ции свидетельствует о накоплении связанных сульфидов в осадке с течениемвремени. Небольшое количество серы, обнаруживаемое в контроле без ино-кулята, связано с внесением абиогенного сероводорода в форме Na2S в пита-тельную среду в качестве восстановителя. Теоретически в условиях пита-тельной среды, использованной в наших экспериментах, могут образовывать-ся нерастворимые соединения фосфата железа, о чем свидетельствуют не-большие пики фосфора, обнаруженные как в контроле без инокулята, так и вэкспериментах на разных сроках культивирования. Присутствие кислородаможет быть связано с частичным окислением меди до оксидов в процессеподготовки пробы для энергодисперсионного анализа.Таким образом, температура +28ºС является оптимальной для получениясульфидов меди с использованием устойчивого к высоким концентрацияммеди штамма бактерий Desulfovibrio sp. R2. Можно предположить наличиенескольких кристаллических фаз сульфидов меди и смешанных сульфидовмеди и железа при биогенном осаждении двухвалентной меди, а также сменуодних форм сульфидов другими при увеличении срока культивирования.

Скачать электронную версию публикации