MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF REGIONS OF CHROMOSOMEATTACHMENT TO NURSE CELLS NUCLEAR ENVELOPE OF ANOPHELESMALARIA MOSQUITOES FROM «MACULIPENNIS» COMPLEX.pdf Проблема организации генома в пространстве ядра в настоящее время яв-ляется чрезвычайно актуальной. Выделяют три иерархических уровня кон-троля генетической экспрессии - последовательность ДНК, структуру хрома-тина и внутриядерную организацию генетического материала [1, 2].Контроль экспрессии генов на первом уровне довольно хорошо изучен - онсвязан с работой цис-регуляторных элементов, таких как промоторы, энхансеры,сайленсеры, и транс-регуляторных факторов, включающих ДНК-связывающиетранскрипционные факторы и аппарат транскрипции. Второй уровень регуляциигенетической экспрессии связан с представлениями о нуклеосомном коде, когда,главным образом, посттрансляционные модификации гистонов определяюттранскрипционный статус последовательности ДНК. Наиболее сложная системаконтроля работы генома осуществляется на третьем уровне.Оказывается, что все процессы в ядре происходят в определенной областиядра. Так, было отмечено, что гетерохроматин, который представляет собой восновном повторенные последовательности, небольшое количество геновлибо участки генома, в которых транскрипция репрессирована, локализован,прежде всего, на периферии ядра, в то время как активно экспрессирующиесяучастки расположены в центре ядра [3]. Позиционирование хромосом в про-странстве ядра происходит за счет взаимодействия хроматина с белкамиядерного матрикса и, прежде всего, с белками ядерной ламины, которая рас-положена между внутренней ядерной мембраной и периферическим хрома-тином. В состав ядерной ламины входят фибриллярные белки - ламины ибелки внутри ядерной мембраны, которые с ними ассоциированы [4]. С эти-ми белками взаимодействуют как белки хроматина, так и ДНК. За контакт сбелками ядерного матрикса отвечают последовательности SAR/MAR (scaffoldassociated region/matrix attached region) [5].Изучение районов хромосом, осуществляющих контакт с ядерной оболоч-кой, имеет большое значение, т.к. неизвестны механизмы формирования ихорганизации в пространстве в разных тканях и у разных видов. Интереснымобъектом для исследования районов прикрепления хромосом к ядерной обо-лочке являются малярийные комары Anopheles комплекса maculipennis.В клетках слюнных желез, мальпигиевых сосудов, трофоцитов яичников этихнасекомых формируются политенные хромосомы.Ранее было отмечено [6], что близкородственные виды малярийных кома-ров комплекса maculipennis отличаются по пространственной организациихромосом в ядрах трофоцитов, а именно - по наличию либо отсутствию кон-тактов с оболочкой ядра, районам локализации этих контактов на хромосо-мах и морфологическим особенностям районов прикрепления. Так, напри-мер, у An. messeae Fall. Х-хромосома взаимодействует c ядерной оболочкойрайоном 2b-c, который находится в середине плеча, хромосома 2 не образуетконтакта с ядерной оболочкой, а хромосома 3 крепится к оболочке ядра при-центромерным районом. Пространственная организация хромосомAn. atroparvus van Thiel. отличается от An. messeae только по Х-хромосоме,которая образует контакт с оболочкой ядра прицентромерным районом. Сле-дует отметить, что несмотря на сходство взаимоотношения хромосом 2 и 3 сядерной оболочкой, у этих видов морфологические особенности районовприкрепления являются специфичными.Целью настоящего исследования было определить первичную последова-тельность ДНК района прикрепления XL-хромосомы An. messeae (района2b-c), а также провести сравнительный анализ этой последовательности с по-следовательностями ДНК районов прикрепления хромосом 3R An. messeae(района 32d) и XL An. atroparvus (района 5а). Результаты данной работы по-зволят определить последовательности ДНК, которые характеризуют районыприкрепления, а также выявить межвидовые особенности и различия после-довательностей этих районов разных хромосом одного вида.Материалы и методы исследованияМикродиссекция хромосом. В качестве материала для исследования ис-пользовали малярийных комаров Anopheles комплекса maculipennis. СамкиМолекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом 125An. messeae были собраны в природных популяциях, а самки An. atroparvusбыли взяты из лабораторной культуры. Препараты готовили по стандартнойметодике [7]. Проводили микродиссекцию трех районов политенных хромо-сом - района 2b-c XL-хромосомы An. messeae (рис. 1, А), 5а XL An. atroparvus(рис. 1, Б) и 32d An. messeae (рис. 1, В) - как описано в [8].Рис. 1. Хромосомы XL An. messeae (А), XL An. atroparvus (Б), 3R An. messeae (В):контуром выделены микродиссектированные районы 2b-c An. messeae, 5аAn. atroparvus и 32d An. messeae; масштабная линейка 20 мкмПолучение библиотеки клонов ДНК района 2b-c An. messeae в плазмидеpJET 1.2/blunt. Библиотеку клонов ДНК района 2b-c An. messeae получали вплазмиде pJET 1.2/blunt с использованием наборов реактивов CloneJet PCRCloning Kit (Fermentas), TransformAid Bacterial Transformation Kit (Fermentas),GeneJet Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) согласно предложенным протоко-лам. Было получено 485 колоний E. coli несущих плазмиды со встройками, ивыделено 323 образца плазмидной ДНК.Определение первичной последовательности ДНК района 2b-cAn. messeae. Определение первичной последовательности в настоящей рабо-те осуществляли с помощью четырехкапиллярного автоматического анализа-тора 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems). Была получена первичнаяпоследовательность для 300 фрагментов ДНК изучаемого района.Анализ последовательности ДНК района 2b-c An. messeae in silico. По-лученные после секвенирования последовательности ДНК клонов анализиро-вали in silico. Последовательность клонов проверяли на гомологию с генома-ми An. gambiae в TBLASTX VectorBase (vectorbase.org/Tools/BLAST/), с ге-номами видов Drosophila в BLASTN Ensembl Metazoa (metazoan.ensembl.org/Anopheles_gambiae/blastview/) и FlyBase (flybase.org/blast). Кроме того, былпроведен поиск мобильных генетических элементов (МГЭ) с помощью про-грамм RepeatMasker (repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker) и Censor(girinst.org/censor). Полученные последовательности анализировали на нали-чие тандемных повторов в TandemRepeatsFinder (tandem.bu.edu/trf/trf.html).Была проведена оценка фрагментов на потенциальное сродство с белкамиядра с использованием программы ChrClass [9].Дот-блот-гибридизация ДНК проб районов 32d An. messeae и 5aAn. atroparvus с библиотекой клонов района 2b-c An. messeae. Для приготовле-126 Г.Н. Артемов, В.Н. Стегнийния зонда использовали реакцию ник-трансляции в присутствии биотин-11-дУТФ. Около 50 нг ДНК клонов библиотеки района 2b-c An. messeae после ам-плификации плазмидной ДНК наносили на положительно заряженную нитро-целлюлозную мембрану (Fermentas). Гибридизацию, отмывку и детекцию про-водили с помощью Biotin detection kit (Fermentas) по предложенному протоколу.Результаты исследования и обсуждениеОбщая протяженность области, первичная последовательность которойоколо 72 тыс. п. н. 58% AT-пар нуклеотидов, позволяет утверждать, что рай-он 2b-c представляют АТ-богатые последовательности. ПоследовательностьДНК этого района анализировали на предмет МГЭ, тандемных повторов игенов. В изучаемом районе были выявлены все классы нуклеотидных после-довательностей. Тандемных повторов обнаружено мало (табл. 1). Среди нихвыявлены микросателлиты (Mes2b-c_273, Mes2b-c_426, Mes2b-c_430) и ми-нисателлиты (Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_229, Mes2b-c_273, Mes2bc_353) с небольшим числом копий.Т а б л и ц а 1Тандемные повторы района 2b-c An. messeaeКлон 2b-cAn. messeae Последовательность консенсуса ДлинаконсенсусаЧислоповторовMes2b-c_2 AGGAAGAAAACAG 13 2Mes2b-c_157 TTATGATGAAAAAG 14 1,9Mes2b-c_229 GAAGTATGAAAGA 13 3,8Mes2b-c_273 AAAG 4 8,8Mes2b-c_353 TTTTGTTTTGTTTGG 15 1,9Mes2b-c_426 TAC 3 40,7Mes2b-c_430 TC 2 13,5Сателлитов обнаружить не удалось, видимо, по той причине, что анализуподвергались фрагменты, по длине не превышающие в среднем 250 п. н.Следует обратить внимание, что тандемные повторы, которые входят в со-став клонов Mes2b-c_2, Mes2b-c_157, Mes2b-c_175, Mes2b-c_229 и Mes2bc_273, имеют мотивы AAG/AAAG/ AAAAG/AAAAAG. Эти мотивы гомоло-гичны консенсусу AAAAG, описанному для ДНК ядерной ламины гепатоци-тов мыши [10].Анализ показал большое разнообразие МГЭ в районе 2b-c An. messeae(табл. 2). Были обнаружены LTR-ретротранспозоны и LINE-элементы, а так-же транспозоны, однако SINE, MITE и гелитроны в районе 2b-c не найдены.Были выявлены МГЭ, характерные для An. gambiae, а также МГЭ, описанныеу представителей одноклеточных, позвоночных, растений и других таксонов.Эти МГЭ имеют довольно низкий процент дивергенции с обнаруженными уAn. messeae даже по сравнению с МГЭ семейства Gypsy An. gambiae.Поиск уникальных последовательностей в районе 2b-c An. messeae позво-лил выявить пять генов (табл. 3). Найденные уникальные последовательностиМолекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом 127оказались гомологичны генам An. gambiae, функция которых неизвестна. Од-нако для большинства генов были определены ортологи у D. melanogaster.Т а б л и ц а 2Мобильные элементы района 2b-c XL хромосомы An. messeaeСемейство MГЭ MГЭ/организм Гомология,%L1 L1_SS, L1MC4_5end, L1_Mur2_orf2, L1MA6,L1MB3_EC, L1MB 75-91CR1 L2A/Eutheria; CR1-4_AG/Anopheles gambiae 66-71RTE RTE-9_SP/Strongylocentrotus purpuratus 88; 91Penelope Penelope-13_HM/Hydra magnipapillata 91R4 EhRLE2/Entamoeba histolytica 72LINEOutcast Outcast/Anopheles gambiae 74LTR/Gypsy Gypsy43-I_AG-int/Anopheles gambiae 70LTR/BEL BEL13-I_AG/Anopheles gambiae 65; 71LTR TONT1_LE_I/Solanum lycopersicum;AGM1/Anopheles gambiae 79; 67LTRERV/ERV1 HARLEQUIN, ZFERV-2-I_DR/Chordata 72; 80EnSpm EnSpm-3_HV/Triticeae, EnSpm-6_VV/Vitis vinifera 67-83DNA/P P1_AG/Anopheles gambiae 89-94Sola Sola1-7_AP, Sola1-9_AP/Acyrthosiphon pisum 91; 72Polinton Polinton-2_NV/Nematostella vectensis 72MuDR MUDSOLT1/Solanum tuberosum 76hAT CHARLIE3/Eutheria 86Chapaev Chapaev3-2_AC/Oryzias latipes 69ТранспозоныpiggyBac/Looper LOOPERN2_DR/Danio rerio 72Примечание. Жирным шрифтом выделены МГЭ, описанные у An. gambiae.Т а б л и ц а 3Генетический состав района 2b-c An. messeaeКлон 2b-c Гомолог у An. gambiaeAn. messeae Ген E-value Хромосома/районОртолог уD. melanogasterMes2b-c_144 AAGAP000357 5,5e-07 XL/3B -Mes2b-c_198 AAGAP006662 2e-10 2L/25D CG3165Mes2b-c_255 AAGAP001531 3e-23 2R/8B CG6125Mes2b-c_263 AAGAP005897 3e-04 2L/23С CG5087Mes2b-c_425 AAGAP000621 2e-47 X/1C, X/5D CG3108Примечание. E-value - вероятность случайной гомологии.С целью поиска последовательностей гомологичных для районов прикре-пления хромосом An. messeae был проведен скрининг библиотеки клоноврайона 2b-c An. messeae с использованием ДНК района прикрепления хромо-сомы 3R An. messeae (район 32d). В результате эксперимента было показано,что общими для районов 2b-c и 32d An. messeae являются последовательно-сти МГЭ типа DOC6_DM, ретротранспозоны семейств L1 и Erv (табл. 4). По-следовательность клона Mes2b-c_403, которая представлена в прицентромер-ных районах хромосом X, 2L, 2R и некартированных сайтах An. gambiae,128 Г.Н. Артемов, В.Н. Стегнийимеет свойство образовывать контакт с ядерной ламиной. Однако с большейдостоверностью ДНК ядерной ламины выявлялась в клонах, содержащихМГЭ L1MC4_5end и HARLEQUIN. Все клоны, кроме Mes2b-c_417, обладаютсвойствами потенциального взаимодействия с ядерными структурами.Т а б л и ц а 4Характеристика гомологичных последовательностей районовприкрепления хромосом XL и 3R An. messeaeКлон 2b-c МГЭAn. messeae Название Гомология, %Взаимодействие с бел-ками или SAR/MARMes2b-c_18 DOC6_DM 44 СК, SAR/MARMes2b-c_346 L1MC4_5end 85 Ядерная ламинаMes2b-c_383 HARLEQUIN 72 Ядерный матрикс,ядерная ламинаMes2b-c_390 L1HS 91 Ядерный матриксMes2b-c_417 L1MEf_5end 75 -Тандемные повторыКонсенсус ПериодMes2b-c_431 AAAACACATT 2,2 Ядерный матриксДругие последовательностиMes2b-c_204, Mes2bc_277, Mes2b-c_395,Mes2b-c_432, Mes2bc_403, Mes2b-c_455Ядерный матрикс,SAR/MAR,СКядерная ламинаПримечание. СК - синаптонемальный комплекс.Для поиска эволюционно-консервативных элементов, которые характери-зуют районы прикрепления XL-хромосом видов An. messeae и An. atroparvus,был проведен скрининг библиотеки клонов 2b-c An. messeae с помощьюДНК-пробы района 5а An. atroparvus (табл. 5). В результате скрининга быловыявлено 11 последовательностей, среди которых отсутствовали кодирую-щие белки. Около половины выявленных клонов представляли собой рет-ротранспозоны, и лишь в одном клоне (Mes2b-c_199) был найден тандемныйповтор. Большинство фрагментов после анализа в программе ChrClass былоотнесено к классу взаимодействующих с белками розеткоподобных структури внутриядерным матриксом фибриллярно-гранулярной сети. В ходе анализабыли найдены клоны, характерные для 2b-c An. messeae, 32d An. messeae и 5аAn. atroparvus, - LINE-элементы (Mes2b-c_390 и Mes2b-c_417), и последова-тельность клона Mes2b-c_395, которая способна потенциально взаимодейст-вовать с белками ядерного матрикса.Таким образом, было установлено, что в состав района 2b-c XL-хро-мосомы An. messeae входят в основном повторенные последовательности -тандемные повторы и мобильные элементы, тогда как генов в данном районеобнаружено мало. Эти данные свидельствуют о сходстве первичной последо-вательности района 2b-c с гетерохроматиновыми районами хромосом.В результате сравнения последовательностей ДНК районов прикрепленияхромосом разных видов были выявлены гомологичные последовательности,Молекулярно-генетический анализ районов прикрепления хромосом 129большая часть которых способна взаимодействовать с белками внутриядер-ных структур.Т а б л и ц а 5Характеристика последовательностей, общих для районов прикрепленияхромосомы XL An. messeae и An. atroparvusКлон 2b-c МГЭAn. messeae Название Гомология, %Взаимодействие сбелками илиSAR/MARMes2b-c_3 Gypsy43-I_AG-int 70,79 Ядерная ламинаMes2b-c_243 ERV3 90,62 -Mes2b-c_390 L1HS 91,20 Ядерный матриксMes2b-c_417 L1MEf_5end 75,00 -Тандемные повторыКонсенсус ПериодMes2b-c_199 ТТТТТТС 2,9 -Другие последовательностиMes2b-c_153 Ядерная ламинаMes2b-c_158, Mes2b-c_195,Mes2b-c_337, Mes2b-c_395,Mes2b-c_418Ядерный матриксЭти данные свидетельствуют о функциональном сходстве этих районов,которое является отражением их свойства взаимодействовать со структурны-ми элементами ядра. Однако районы прикрепления разных хромосом должныиметь различия в организации, которые определяют специфику их взаимоот-ношения с ядерной оболочкой. Результаты сравнения последовательностейДНК хромосом позволили выявить эти различия.Предположено, что районы прикрепления хромосом составляют следую-щие элементы: 1) эволюционно консервативные (обнаруженные в результатесравнения 2b-c An. messeae и 5а An. atroparvus); 2) специфичные для каждогорайона прикрепления (последовательности района 2b-c, не выявленные прискрининге библиотеки клонов); 3) консервативные для всех районов прикре-пления хромосом (гомологичные последовательности трех сравниваемыхрайонов прикрепления). Гипотеза подтверждается данными анализа последо-вательности ДНК прицентромерного района хромосомы 2 An. atroparvus [11],в котором авторы выявили хромосомоспецифичные и универсальные после-довательности.Полученные результаты указывают на сложную организацию районовприкрепления хромосом. Необходимо определить причины разнообразияМГЭ в этих районах. Возможно, что перемещения МГЭ и ассоциированных сними SAR/MAR способны изменять локализацию районов прикрепления нахромосомах либо приводить к возникновению новых сочетаний ассоцииро-ванных с ядерной оболочкой последовательностей и тем самым изменятьпространственную организацию ядра.

Скачать электронную версию публикации