Study of influence of heterologous HMG1 gene on leaf mesostructure and resistance of the transgenic tobacco plants to Pseudomonas syringae.pdf Изопреноиды являются одним из самых многочисленных классов природ-ных соединений растений. Они участвуют как в регуляции роста, развития иразмножения растений, так и в процессах взаимодействия растений с абиоти-ческими условиями среды и другими организмами - насекомыми, бактерия-ми, грибами. Биосинтез изопреноидов в растениях происходит при участиидвух метаболических путей - метилэритритолфосфатного, локализованного вхлоропластах [1], и мевалонатного, находящегося в цитоплазме [2]. Цито-плазматический синтез изопреноидов начинается с конденсации трех моле-кул ацетил CoA, которые с помощью фермента 3-окси-3-метилглутарил-КоАредуктазы превращаются в мевалоновую кислоту. Фермент 3-окси-3-метил-глутарил-КоА редуктаза кодируется геном hmg1 [3]. При участии данногопути биосинтеза образуются такие изопреноиды, как брассиностероиды, фи-тостерины, некоторые фитоалексины, изопреноидные фрагменты цитокини-нов и убихинонов [4]. Можно предположить, что усиление биосинтеза мева-лоновой кислоты приведёт к росту уровня фитогормонов, стеринов и фитоа-лексинов, что в свою очередь может сказаться на структуре тканей листа иустойчивости растений к фитопатогенам.Цель работы - изучение у модельного объекта Nicotianа tabacum L. эф-фектов введения гетерологичного гена hmg1 в разных ориентациях относи-тельно промотора на структуру листа и устойчивость к биотическому стрес-су, вызванному биотрофным фитопатогеном Ps. syringae, распространениекоторого происходит по межклеточному пространству в мезофилле.Материалы и методики исследованияОбъектом исследования служили трансгенные растения табака сорта Сам-сун, содержащие гетерологичный ген hmg1 из Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.под контролем конститутивного двойного промотора CаMV 35S вируса мо-заики цветной капусты [5]. Линии растений с антисмысловой копией генаhmg1 (антисмысловые формы) обозначены как А1 и А2, а линии растений сосмысловой формой гена hmg1 (смысловые формы) - С1, С2 и С4. Растенияразмножали в условиях in vitro на среде МС [6] с добавлением 50 мг/л суль-фата канамицина и в возрасте 3-4 недель пересаживали в грунт. Далее расте-ния выращивали в условиях закрытого грунта на станции искусственногоклимата «Биотрон». В работе использовали штамм Pseudomonas syringae-1546, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов Институтабиохимии и физиологии микроорганизмов РАН. Мезоструктуру листа опре-деляли согласно методике Мокроносова и Борзенковой [7, 8] с использовани-ем программного обеспечения Siams Mesoplant. Определение стеринов про-водили колориметрическим методом [9] с небольшими модификациями, из-меряя количество стеринов по реакции неомыляемого остатка растительныхэкстрактов с реактивом Бурхарда-Либермана. Для разделения стеринов напластинках Silufol использовали систему «гексан : диэтиловый эфир : уксус-ная кислота» (70 : 30 : 2).Оценку устойчивости к биотическому стрессу проводили на листьяхсреднего яруса 8-недельных растений табака. Для этого листовые дискидиаметром 20 мм выдерживали 3 мин в ночной культуре Ps. syringae либо вводе, после чего инкубировали 42 ч при температуре 24-26°С во влажнойкамере. Оценивали такие показатели стресса, как уровень перекисногоокисления липидов (ПОЛ) [10], активность пероксидазы [11], содержаниесвободного пролина [12] и флавоноидов [13]. Статистическая обработка ипостроение графиков выполнено в программе StatSoft Statistica 8.0 и MSExcel 2003. Все данные представлены как средние значения и их стандарт-ные ошибки. Статистическая обработка данных проведена с использовани-ем критерия Манна-Уитни. Различия статистически значимы при p ≤ 0,05.Корреляционный анализ проведён с вычислением коэффициента корреля-ции Пирсона.Результаты исследования и обсуждениеТрансгенные растения со смысловой копией гена hmg1 в геноме являютсямоделью для исследования влияния усиления мевалонатного пути биосинтезаизопреноидов в растениях, тогда как трансгенные линии с антисмысловойкопией гена hmg1 позволяют моделировать его ослабление. Полученные на-ми ранее трансгенные растения табака с геном hmg1 в разных ориентациях поотношению к промотору (линии А1, А2, С1, С2, С4) создают возможностьнаблюдать эффекты, связанные с изменением цитоплазматического биосин-теза изопреноидных соединений.Морфология растений. Отличий в высоте, скорости роста и времени на-чала цветения между контрольными и трансгенными растениями табака намине обнаружено. Согласно данным других исследований, мутанты по генуhmg1 отличались низкой высотой растений и задержкой цветения [14]. В на-шем случае отсутствие различий в ростовых показателях может быть объяс-нено недостаточной супрессией гена hmg1 при использовании технологииантисмысловых РНК.Анализ стеринов. Большинство стеринов растений являются компонен-тами мембран, отвечая за ее текучесть и проницаемость. Некоторые стериныили продукты их превращений могут служить сигнальными молекулами впроцессах роста и развития растений [15]. Механизм, отвечающий за гомео-стаз стеринов в растениях, изучен недостаточно, однако показано, что актив-ность 3-окси-3-метилглутарил-КоА редуктазы табака возрастает при умень-шении эндогенных стеринов [16].В листьях исследованных нами растений суммарное содержание стериновизменялось в зависимости от фазы развития. До цветения количество стери-нов в листьях контрольных и антисмысловыхРис. 1. Содержание стеринов в листьях табакадо цветения растений. По оси абсцисс - линии растений табака:контроль - нетрансформированные растения; А1 - трансгенные растениятабака с антисмысловой формой гена hmg1; С1, С2, С4 - линии трансгенныхрастений табака со смысловой формой гена hmg1Мезоструктура листа. Под мезоструктурой листа подразумевают органи-зацию фотосинтетического аппарата растений на клеточном и тканевомуровнях. Исследование показало, что у антисмысловых линий растений про-исходило уменьшение толщины листа на 16% (рис. 2) и увеличение количе-ства клеток мезофилла на 59% по сравнению с контролем (рис. 3). При этомразмеры клеток столбчатого и губчатого мезофилла изменялись незначитель-но (линия А1) или увеличивались (линия А2) (рис. 4). Такое изменение дан-ных параметров может свидетельствовать о более плотной упаковке клеток влисте антисмысловых форм растений. У смысловых растений наблюдалиразличия между линиями. В линии С1 отличий от контроля в толщине листане было, а листья линий С2 и С4 были на 18-19% тоньше (рис. 2). Количест-во клеток мезофилла во всех линиях смысловых растений достоверно не из-менялось (рис. 3). Объем клеток столбчатого мезофилла увеличивался во всехлиниях смысловых растений (рис. 4). Таким образом, в растениях смысловыхлиний С2 и С4 упаковка клеток в листе более плотная, чем в контроле.Ткань листа растений линии С1 более рыхлая по сравнению с контролем.Это подтверждается расчетными данными доли мезофилла в объеме листа ииндексом поверхности наружных мембран клеток, представленными в табли-це. Удельная поверхностная плотность листьев у антисмысловых линий не от-личалась от контроля, тогда как у смысловых линий она была выше на 8-30%(рис. 5). Это может свидетельствовать как об увеличении степени васкуляриза-ции листа смысловых форм растений, так и об увеличении толщины кутикулылиста. Возможно, в растениях со смысловой формой гена hmg1 повышен уро-вень брассиностероидов, которые стимулируют развитие элементовческому стрессу, возможно, за счёт изменения скорости распространения па-тогена по тканям растений.Рис. 2. Толщина листа у контрольных и трансгенных растений табакас геном hmg1Рис. 3. Количество клеток мезофилла в листьях табакаРис. 4. Объем клеток мезофилла в листьях табакаРис. 5. Удельная поверхностная плотность листьев (УППЛ)Расчётные показатели мезоструктуры листаЛиния растений табака Индекс мембран клеток Доля мезофиллав объёме листаКонтроль 1,9 0,3А1 3 0,46С1 1,9 0,25С2 2,5 0,4С4 2,3 0,51Устойчивость к биотическому стрессу. Цитокинины и брассиностерои-ды, синтез которых связан с мевалонатным путем, играют значительную рольв адаптации растений к стрессам [17, 18]. Кроме того, через этот путь синте-зируются и некоторые фитоалексины, которые в семействе пасленовых пред-ставлены сесквитерпеноидами [19]. К факторам, влияющим на устойчивостьк заболеваниям, помимо гормонов и фитоалексинов относят строение по-кровных тканей и анатомические особенности листа. В связи с этим изучениеустойчивости полученных трансгенных растений к биотическому стрессупредставляет значительный интерес. В качестве фитопатогена использовалибактерии Pseudomonas syringae. После воздействия бактерией Ps. syringaeПОЛ у растений смысловых линий С2 и С4 не изменился, что свидетельство-вало об отсутствии у этих линий стресса (рис. 6). В контроле, растениях ан-тисмысловых линий и линии С1 в тех же условиях этот показатель возрос на40-70%.Во всех исследуемых вариантах произошло возрастание содержания сво-бодного пролина (рис. 7), но наиболее значительно - у смысловых линий (на300%), что говорит о высокой сопротивляемости данных растений к дейст-вию биотического стресса. На усиление стресса у растений антисмысловыхформ и в линии С1 указывало повышение активности гваяколовой перокси-дазы (рис. 8). При этом в контрольных и растениях смысловых линий С2 и С4активность фермента не изменялась, свидетельствуя об отсутствии накопле-ния в них перекиси при данном стрессе.Рис. 6. Уровень перекисного окисления липидов в листьях контрольныхи трансгенных растений табака с геном hmg1 после инкубации с Ps. syringae.По оси ординат - содержание продуктов ПОЛ, реагирующихс тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП)Рис. 7. Содержание пролина в тканях табака после инкубациис Ps. syringaeРис. 8. Активность гваяколовой пероксидазы в листьях растений табакапосле воздействия Ps. syringae. По оси ординат - активность фермента,выраженная в мкМ окисленного за 1 мин гваякола/1 мг белкаСодержание флавоноидов в листьях антисмысловых форм растений повы-силось на 12-19%, а в смысловых линиях С2 и С4 - снизилось на 25-29%.В контроле и в линии С1 этот параметр уменьшился на 13 и 15% соответст-венно. Это может свидетельствовать о росте сопротивляемости растенийсмысловых линий С2 и С4 к действию патогена за счёт активации синтезалигнина и тушения активных форм кислорода [20].На седьмые сутки эксперимента на листовых дисках контрольных и анти-смысловых линий растений проявлялись признаки хлороза, указывая на по-ражающее действие патогена, при этом экспланты смысловых форм расте-ний, в особенности линий С2 и С4, оставались зелёными.Корреляционный анализ взаимосвязи плотности упаковки листа и физио-логических показателей стресса для контрольных растений и линий С1, С2 иС4 подтверждает, что плотность упаковки листа играет значительную роль вформировании устойчивости к исследованному фитопатогену. Показанысильная обратная корреляция (r = -0,9) между долей мезофилла листа в этихрастениях и уровнем ПОЛ в них после воздействия патогена, а также средняяобратная корреляция (r = -0,7) между долей мезофилла листа и активностьюпероксидазы. Для антисмысловых линий табака корреляции между даннымипризнаками не выявлено. Все эти факты говорят о повышенной устойчивостик биотическому стрессу растений смысловых линий С2 и С4 и о сниженииустойчивости у растений табака с антисмысловой копией гена hmg1. Можносделать вывод, что экспрессия гена hmg1 вызывает повышение устойчивоститрансгенных растений к действию биотического стресса. Для объяснения по-ниженной устойчивости к нему смысловой линии С1 в настоящее время про-водится анализ уровня экспрессии гена hmg1.Таким образом, исследована экспрессия гена hmg1 в различных ориента-циях по отношению к промотору в трансгенных растениях табака. Показаныизменения в содержании суммы стеринов листьев растений, появление отли-чий в анатомии листа и повышение устойчивости некоторых трансгенныхрастений к Pseudomonas syringae.Авторы M~п,выражают благодарность кандидату биологических наук Н

Скачать электронную версию публикации