Biological activityspirit extraction from the duckweed small (Lemna minor L.) concerninginflammation process.pdf ВведениеИз народной медицины известно, что некоторые представители рода ряска(Lemna L., семейство рясковых Lemnaceae S.F. Gray) являются лекарствен-ными растениями. Настои из травы ряски издавна использовались в качествежаропонижающего, мочегонного, желчегонного, противоглистного и анти-микробного средства [1]. Особый интерес представляет ряска малая (Lemnaminor L.). Этот вид достаточно широко распространен в Западной Сибири, втом числе и в Томской области, а сведения о лекарственных свойствах этогорастения встречаются в литературе наиболее часто [2, 3].Кроме того, изучен химический и минеральный состав этого растения всравнении с другим распространенным в нашем регионе видом ряской трех-дольной (L. trisulca) [4]. Установлено, что в растениях рода ряска присутст-вуют в разных количествах флавоноиды, полисахариды, аминокислоты, али-фатические кислоты, фенилкарбоновые кислоты, антоцианы, тритерпеновыесоединения [5]. Ряска малая отличается значительно большим содержаниемжелеза, цинка, меди, марганца, магния, кобальта, кремния и йода, чем ряскатройчатая [4].Результаты изучения химического и минерального состава растений родаряска позволяют предполагать широкий спектр биологической активностисуммарных извлечений из лекарственного сырья. Однако в ранее проведен-ных исследованиях изучена только противогрибковая активность водных испиртовых экстрактов в отношении дерматофитов и показаны сорбционныесвойства измельченного сырья, сравнимые с активированным углем [6]. Цельнастоящего исследования - изучение биологической активности спиртовыхизвлечений из ряски малой в отношении воспаления разного генеза.Материалы и методики исследованияИсследование проведено в зимний период в одинаковом диапазоне темпе-ратур на самцах мышей и крыс массой 20-23 и 200-250 г соответственно. Вы-сушенный спиртовой экстракт ряски малой на физиологическом растворе вво-дили перорально с помощью зонда в течение 5 дней до эксперимента одно-кратно в сутки в дозе 100 или 200 мг/кг в утренние часы. В контрольных экс-периментах вводили в эквиобъемных количествах физиологический раствор(0,2 мл на 100 г массы тела). Сухой экстракт ряски малой представляет собойтвердую хрупкую массу темно-коричневого цвета, полученную путем экстрак-ции из травы ряски 40%-ным раствором этанола (методом реперколяции) идальнейшего высушивания полученного экстракта до сухого состояния.Изучение влияния экстракта ряски на процесс воспаления изучали на мы-шах и крысах на моделях каррагенинового экссудативного отека, острыхстрессорных и пептических повреждений стенки желудка (в виде язв).Острый экссудативный отек вызывали с помощью флогогена каррагенина,который вводили субплантарно в одну из лапок животного (0,05 мл 1%-ногораствора) через 1 ч после последнего введения экстракта ряски [7]. Величинуотека определяли через 3,5 ч после введения флогогена по разности масс вос-паленной и здоровой конечностей животного, которые определяли после егодекапитации под эфирным наркозом. Противовоспалительный эффект, оцени-ваемый по уменьшению отека, выражали в процентах к контролю. Об интен-сивности воспаления судили по процентным показателям прироста и угнетенияотека, которые рассчитывали по формулам: 1) % прироста отека = {массабольной конечности - масса здоровой конечности / масса здоровой конечно-сти} . 100%; 2) % угнетения отека = [% прироста массы конечности (кон-троль) - % прироста массы конечности (опыт) / % прироста массы конечности(контроль)] . 100% [7]. В качестве препарата сравнения использовали офици-нальное нестероидное противовоспалительное средство с выраженным проти-вовоспалительным эффектом - индометацин в дозе 50 мг/кг внутрь.Деструктивные повреждения стенки желудка мышей стрессорного ха-рактера вызывали длительной иммобилизацией животных по методуЮ.И. Добрякова [8]. Иммобилизация мышей осуществлялась на протяже-нии 18 ч после последнего введения экстракта в дозах 100 или 200 мг/кг,затем проводилась декапитация животных под эфирным наркозом. Желудкиизвлекали, вскрывали по малой кривизне, промывали холодным физиоло-гическим раствором и макроскопически с помощью лупы при ярком осве-щении определяли число и площадь деструкций, которые дифференцирова-ли на точечные (менее 1 мм), крупные (более 1 мм) и полосовидные. Под-считывали среднее количество изъязвлений на одно животное в группе,процент животных с язвами. Индекс Паулса (ИП) определяли как инте-гральный показатель количества деструкций по формуле: ИП = (среднееколичество язв . % животных с язвами)/100%. Противоязвенную актив-ность (ПА) препаратов определяли как отношение индекса Паулса в кон-трольной группе к индексу Паулса в опытной группе. Исследуемое средст-во считали активным, если ПА составляло 2 и более единиц [8].Острые деструктивные повреждения в стенке желудка в виде пептическихязв моделировали по методу H. Shay [9]. В эксперименте были использованыкрысы. Моделирование острой пептической язвы проводили в утренние часыпосле 18 ч голодания при свободном доступе к воде и через 24 ч после по-следнего введения экстракта ряски в дозе 200 мг/кг. Под эфирным наркозомосуществляли полную перевязку лигатурой пилорического отдела желудка на18 ч до момента декапитации. После этого извлекали желудок и оценивалисостояние его стенки по количеству деструктивных поражений и индексуПаулса, а содержимое желудка подвергали биохимическому анализу, опреде-ляя кислотность и протеолитическую активность желудочного сока.Протеолитическую активность желудочного сока крыс определяли по ме-тоду Ансона и Мирского в модификации А.М. Уголева [10]. Принцип методаоснован на спектрофотометрическом определении выделившихся в ходе ис-следования аминокислот тирозина и триптофана, которые при взаимодейст-вии с реактивом Фолина-Чокалтеу окрашивают пробы в синий цвет различ-ной интенсивности. Исследуемый желудочный сок доводили до стандартныхусловий pH (1,4-2,4) соляно-кислым буфером. Эта величина pH создает оп-тимальные условия для проявления протеолитической активности пепсинов.Желудочный сок разбавляли буфером в 50 раз. В качестве субстрата для про-теолитических ферментов использовали бычий сывороточный лиофилизиро-ванный белок альбумин.К разведенному желудочному соку добавляли раствор альбумина и длялучшего протекания реакции пробирки ставили в баню в штативе при 37-38.С. Через 30 мин процесс переваривания останавливали 0,3N трихлорук-сусной кислотой. Белок, который не подвергался гидролизу, выпадал в оса-док. Затем к надосадку добавляли 0,5N NaOH, способствующей проявлениюинтенсивности окраски. К полученным пробам приливали фенольный реак-тив Фолина-Чокалтеу. Их оптическую плотность измеряли на спектрофото-метре СФ-46 «Ломо» в красной области светового спектра при длине волны620 нм. Активность пепсинов определяли по калибровочному коэффициентус учетом разведения проб желудочного сока. Калибровочный коэффициентпредставляет собой среднюю величину отношения концентрации тирозина вмкмоль/мл к соответствующей оптической плотности.Активность протеолитических ферментов выражали в мкмоль/мл желу-дочного сока крыс. Пересчет производился по формуле С = Е . 600 . k, гдеС - количество тирозина, характеризующее протеолитическую активностьпепсинов желудочного сока; Е - экстинция пробы на данной длине волны;k - коэффициент калибровки; 600 - стандартный коэффициент пересчетадля желудочного сока. Для определения калибровочного коэффициента ис-пользовали различные разведения исходного раствора кристаллическоготирозина в 0,1N HCI [10].Кислотность желудочного сока оценивалась способом П.А. Канищева иЛ.Г. Коваленко по активности ионов водорода, определяемой с помощью pHжелудочного сока, с последующим вычислением по таблице антилогарифмови выражалась в мкмоль/мл [11].Статистическая обработка полученных результатов выполнена в програм-ме StatSoft Statistica 6.0. Рассчитывали среднее арифметическое значение по-казателя (М), стандартную ошибку среднего арифметического (m). Статисти-ческую значимость различий между сравниваемыми выборками показателейпроводили с помощью непараметрического U-кри-терия Манна-Уитни суровнем значимости p ≤ 0,05 [12].Результаты исследования и обсуждениеВоспаление является универсальной патологической реакцией ткани наместное повреждающее воздействие любого происхождения. Оно протекаетстереотипно в три фазы, запускается и поддерживается медиаторами воспа-ления, которые освобождаются из тучных клеток при повреждении. Тучныеклетки наиболее плотно располагаются в соединительной ткани [13]. Под-кожная соединительная ткань грызунов имеет самую высокую плотностьтучных клеток на единицу поверхности [14], поэтому подкожное введениепровоспалительных агентов, например каррагенина, сопровождается выра-женным отеком [7].Каррагенин представляет собой полисахарид, выделенный из ирландскогоморского мха. Это соединение является одним из самых мощных флогогенов ииспользуется для моделирования экссудативного воспаления в эксперименте [7,14]. Интенсивность каррагенинового отека коррелирует с возрастанием тучнок-леточных медиаторов воспаления - гистамина, серотонина, брадикинина, про-стагландинов, а также резким повышением активности провоспалительных фер-ментов - кислой фосфатазы, циклоксигеназы, липоксигеназы [7, 13].У контрольных и опытных животных отек лапки интенсивно развивался втечение 3-4 ч после субплантарного введения флогогена (в подошвенныйапоневроз), достигая к этому времени максимального пика экссудации.У контрольных животных поврежденнаяТ а б л и ц а 1Влияние экстракта ряски на каррагениновое воспалениеЭкспериментальные серииМасса здоро-вой конечно-сти (М ± m), гМасса конеч-ности с воспа-лением,(M ± m), г% приростаотека% угнетенияотекаФизиологический растворвнутрь + каррагенин под кожу,n = 80,17 ± 0,023 0,25 ± 0,031 50,9 ± 12,1 -Физиологический раствор подкожу, n = 7 0,16 ± 0,014 0,18 ± 0,024 16,0 ± 7,6* -Экстракт ряски внутрь200 мг\кг + каррагенин подкожу, n = 80,15 ± 0,017 0,20 ± 0,023 28,9 ± 3,0** 43,3 ± 5,8**Индометацин внутрь 50 мг/кг +каррагенин под кожу, n = 7 0,15 ± 0,018 0,18 ± 0,023 20,7 ±6,6***59,3 ±13,1***Примечание. М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднегоарифметического; n - количество животных; * р2-1 ≤ 0,05 при U= 0; ** р3-1 ≤ 0,05 приU = 0; *** р1-4 ≤ 0,05 при U = 0.Иммобилизационный стресс, создаваемый по методу Ю.И. Добрякова [8],нередко используется для оценки адаптогенных возможностей новых биоло-гически активных соединений, а также для создания острого нейрогенногоэрозивного или язвенного воспаления слизистой или стенки желудка. Меха-низмы этих повреждений полностью определяются стрессорными нейрогумо-ральными факторами [15, 16]. Исследовали спиртовой экстракт ряски, кото-рый вводили мышам в дозах 100 и 200 мг/кг. Согласно полученным даннымэкстракт ряски дозозависимо уменьшал в стенке желудка количество изъязв-лений (р < 0,05; табл. 2), что отразилось на индексе Паулса. Если в контролепоследний составлял 5,8 балла, то в опытах с экстрактом ряски он был в2 раза меньше. Следовательно, экстракт ряски продемонстрировал способ-ность ослаблять нейрогенные деструктивные повреждения в стенке желудкав условиях иммобилизационного стресса.Острые деструктивные повреждения в стенке желудка моделировали так-же по методу Shay [9] на крысах. В отличие от предыдущей серии такая мо-дель воспалительных язвенных поражений сочетает в своем генезе нейроди-строфический процесс и пептический фактор [15] и является более жесткоймоделью язвенного воспаления. В контрольных исследованиях было обнару-жено по 2-3 язвы у каждого животного, причем в основном полосовидные иточечные, размером менее 1 мм. У крыс, получавших 5 дней подряд экстрактряски, количество точечных язв было увеличено в 2 раза (р < 0,05) и индексПаулса - также в 2 раза (табл. 3). Таким образом, экстракт ряски не способенподавлять деструктивный воспалительный процесс в стенке желудка, связан-ный с острым пептическим повреждением.В условиях острой пептической язвы определяли кислотность желудочно-го сока по концентрации свободных ионов водорода. Согласно результатам,представленным в табл. 4, экстракт ряски существенно не изменял кислот-ность желудочного сока крыс в указанных условиях.Т а б л и ц а 2Влияние экстракта ряски на деструктивные повреждения в стенке желудкав условиях иммобилизационного стрессаПрепарат Доза,мг/кгКоличествоизъязвлений(М ± m)ИндексПаулсаПротивоязвеннаяактивностьИнтактная группа, n = 6 - - -Физиологический рас-твор внутрь, n = 8 5,8 ± 1,7 5,8 -Экстракт ряски внутрь,n = 9 100 2,0 ± 0,7* 2 2,88Экстракт ряски внутрь,n = 10 200 1,8 ± 1,8** 1,3 4,56Примечание. М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднегоарифметического; n - количество животных; * р3-2 ≤ 0,05 при U= 0; ** р4-2 ≤ 0,05 при U= 5.Т а б л и ц а 3Влияние экстракта ряски на деструктивные повреждения в стенке желудка крысс перевязкой пилорического отделаЭкспериментальные серииКоличествоизъязвленийM±mИндексПаулсаПротивоязвен-ная активностьКонтроль, n = 6 (с лигатурой) 2,2 ± 0,48 1,8Физиологический раствор внутрь + лигатура,n = 7 2,3 ± 0,66 1,9 0Экстракт ряски 200 мг /кг внутрь + лигатура,n = 7 4,5 ± 0,76* 4,5 0Примечание. М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднегоарифметического; n - количество животных; * р3-1 ≤ 0,05 при U= 2; ** р3-2 ≤ 0,05 при U= 1.Т а б л и ц а 4Влияние экстракта ряски на протеолитическую активность и концентрациюсвободных ионов водорода в желудочном соке крыс с перевязкой пилорическогоотдела желудкаЭкспериментальные серии[aH+],мкМ/мл,(M ± m)Протеолитическая актив-ность мкМ/мл, (M ± m)Контроль (с лигатурой), n = 6 0,08 ± 0,004 83,1 ± 18,56Физиологический раствор внутрь + лигатура, n = 7 0,09 ± 0,004 82,3 ± 17,46Экстракт ряски 200 мг/кг внутрь + лигатура, n = 7 0,08 ± 0,004 184,4 ± 5,79**#Примечание. М - среднее арифметическое значение; m - стандартная ошибка среднегоарифметического; n - количество животных; ** р3-1 ≤ 0,05; # р3-2 ≤ 0,05 при U = 2.Однако, как свидетельствуют полученные данные, экстракт ряски увели-чивал на 121% протеолитическую активность желудочного сока у крыс с пе-ревязкой пилорического отдела, что объясняет механизм возникновения де-структивных поражений слизистой (табл. 3, 4). Таким образом, экстракт ряс-ки в исследуемой дозе, не оказывая влияния на кислотность желудочного со-ка, увеличивал его протеолитическую активность.ЗаключениеТаким образом, проведенные исследования биологической активностиэкстракта ряски показали, что в дозе 100 и 200 мг/кг препарат при перораль-ном введении в организм мышей в течение 5 дней оказывал противовоспали-тельное действие на моделях каррагенинового и стрессорного воспаления.Однако на модели пептических деструктивных повреждений стенки желудкакрыс экстракт ряски оказался не только неэффективным, но даже увеличивалколичество пептических язв. При этом препарат, не изменяя кислотность же-лудочного сока, значительно повышал его протеолитическую активность.С одной стороны, это объясняет механизм увеличения под его влияниемколичества деструктивных повреждений стенки желудка в условиях перевяз-ки пилорического отдела и накопления протеолитических ферментов в желу-дочном соке.С другой стороны, полученные результаты указывают на стимуляциюпрепаратом главных клеток желудка, вырабатывающих пепсиноген. Возмож-но, экстракт ряски усиливал гастриновый контроль секреции пепсиногена[13, 14]. На основании проведенных исследований трудно сказать что-либоболее определенное относительно механизма такой стимуляции. Это требуетдальнейших всесторонних исследований.Статья посвящена памяти декана фармацевтическогофакультета Си-бирского государственного медицинского университета профессораС.Е. Дмитрука.

Скачать электронную версию публикации