Effect of the various factors on the chloroplast atpB operon genes transcription.pdf ВведениеБольшинство хлоропластных генов растений объединены в опероны, имею-щие общие регуляторные элементы транскрипции, которые унаследованы отпредшественников хлоропластов - цианобактерий. Однако в ходе эволюции,благодаря существованию пластид внутри эукариотической клетки, возниклиновые механизмы регуляции экспрессии генов, в том числе и на уровне транс-крипции. К ним можно отнести не только появление внутриоперонных промото-ров и генов с интронами, но также появление двух типов принципиально раз-личных РНК полимераз пластидного и ядерного кодирования [1, 2]. В настоящеевремя механизмы регуляции транскрипции отдельных генов в составе хлоропла-стных оперонов у высших растений не изучены, хотя это исключительно важнодля понимания регуляции биогенеза хлоропластов. Цель работы - изучить ин-тенсивность транскрипции генов в составе пластидных оперонов листьев ячменяв зависимости от возраста растений, эффекта фитогормонов и состояния аппара-та транскрипции и выяснить, насколько консервативен механизм регуляциитранскрипции генов в составе оперонов.Материалы и методики исследованияОбъектом исследования служили первые настоящие листья ячменя сортаЛуч (Hordeum vulgare L.) разного возраста (3-, 9- и 18-дневные растения) и 3-дневные белые растения мутанта ячменя albostrians. Выделение хлоропластов,а также run-on транскрипцию в хлоропластных лизатах проводили по методу,описанному в работе [3]. Фрагменты пластидной ДНК, используемые (послеамплификации) в качестве проб при ДНК-РНК гибридизации, были подобраныс применением программы Vector NTI на основании первичной последова-тельности хлоропластного генома ячменя (NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008590). Фрагменты ДНК были нанесены на нейлоновую мембра-ну (Hybond-N, GE Healthcare, США) с помощью прибора для дот-гибридизации(BioRad, США). Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. По-лученные результаты обработаны статистически.Результаты исследования и обсуждениеДля изучения интенсивности транскрипции генов, входящих в состав atpBоперона (рис. 1), были получены гибридизационные пробы, выровненные поразмеру (100 п.н.) и по GC составу (34-36%), что позволило в одних и тех жеусловиях для всех проб проводить анализ интенсивности транскрипции. ДляatpB оперона было подготовлено 9 зондов на: 1 - atpE ген, 2-4 - межгеннуюобласть atpE/ tRNAVal генов, 5-6 - интрон tRNAVal гена, 7-8 - межгенную об-ласть tRNAVal /ndhC генов и 9 - ndhC ген (рис. 1). С помощью зондов был оп-ределен уровень 32P-меченой РНК, синтезированной в ходе реакции транс-крипции в хлоропластном лизате.Рис. 1. Схема расположения генов в atpB опероне. Транскрипция оперонапроисходит слева направо. Транскрипция trnM гена происходит с противоположнойнити справа налево. Локализация гибридизационных проб показана цифрами.* - наличие в гене интронаИз рис. 2 видно, что различные участки atpB оперона транскрибировалисьнеравномерно. Наибольшую транскрипционную активность в межгенномспейсере atpE - trnV генов имел участок, соответствующий пробе 3, в то вре-мя как расположенный рядом участок (проба 4) во всех экспериментах имелнаименьшую активность транскрипции.Вслед за этим активность транс-крипции увеличивалась для интрона trnV гена (пробы 5 и 6), далее почти неменялась для межгенного спейсера trnV - ndhC генов (пробы 7, 8) и имелатенденцию к некоторому снижению для ndhC гена (проба 9). Несмотря наразличное состояние фотосинтетического аппарата у растений разного воз-раста, сходный профиль транскрипции наблюдался для atpB оперона в актив-но растущем первом листе 3-дневных проростков ячменя, в закончившемрост листе 9-дневных растений и в старом листе 16-дневных растений.Характер интенсивности транскрипции изученных генов не изменился ипри обработке листьев АБК и метилжасмонатом, фитогормонами, которыезначительно подавляют транскрипцию (рис. 2).Рис. 2. Относительная интенсивность транскрипции генов atpB оперона ячменяв зависимости от возраста растений (слева) и действия абcцизовой кислоты (АБК)и метилжасмоната (MJ) (справа)Однако у albostrians мутанта ячменя, у которого отсутствует РНК-полимераза бактериального типа, наблюдалось изменение профиля интен-сивности транскрипции генов atpB оперона. Данные рис. 3 показывают, чтобез этой РНК-полимеразы происходит нарушение дифференциальной транс-крипции генов atpB оперона.Рис. 3. Относительная интенсивность транскрипции генов atpB оперонав 3-дневных мутантах ячменя albostrians (слева) и 9-дневных листьях растенийячменя дикого типа (справа). Локализация гибридизационных проб,обозначенных цифрами, показана на рис. 1ЗаключениеПолученные результаты позволяют заключить, что интенсивность транс-крипции генов в составе пластидных оперонов листьев ячменя очень консер-вативна. Профиль транскрипции изученных генов не зависит от возраста рас-тений и воздействия экзогенных фитогормонов (АБК и метилжасмоната).Однако инактивация РНК-полимеразы пластидного кодирования вызываетзначительное изменение интенсивности транскрипции генов atpB оперона.

Скачать электронную версию публикации