Influence of chitabis and its componentson the functional state of the small intestine and blood indices of irradiated a.pdf ВведениеПоиск эффективных средств профилактики и предотвращения лучевыхпоражений человека и животных остается актуальной проблемой радиобио-логии, так как сохраняется опасность радиационного поражения при тех-ногенных и природных катастрофах. Последним свидетельством являетсяавария на АЭС «Фукусима-1» в Японии (2011 г.). Многочисленными иссле-дованиями установлено, что биологически активные вещества природногопроисхождения повышают неспецифическую резистентность организма иуспешно используются для профилактики и терапии различных патологий[1-3], в том числе и лучевых поражений [4-6]. В последние годы ведутся ин-тенсивные исследования хитозана (сополимера D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина), выделенного из панциря крабовых, установлены его сорб-ционные, детоксицирующие, антимикробные, антиоксидантные свойства[7-12], обнаружено выраженное противолучевое действие этого препаратапри внутривенном введении как до, так и после облучения [13]. В лабора-тории радиационной физиологии и биохимии НИИ биологии и биофизикиТомского государственного университета ранее был изучен водный экстрактпихты сибирской - абисиб, обнаружены его бактерицидные, противовоспа-лительные, гемо- и иммуностимулирующие свойства [14]. При исследова-нии комплексного препарата хитабис, представляющего собой раствор хи-тозана в абисибе, установлена его антиоксидантная активность [15]. Крометого, хитабис повышает выживаемость и среднюю продолжительность жиз-ни облученных в дозе LD90/30 экспериментальных крыс в большей степени,чем его компоненты - абисиб и хитозан [16]. Известно, что наиболее радио-чувствительными системами организма являются кроветворная система итонкий кишечник, которым свойственная высокая активность физиологиче-ской пролиферации [17].Цель данной работы - изучение действия хитабиса и его компонентов -абисиба и хитозана - на состояние кроветворения и тонкого кишечника об-лученных животных.Материалы и методики исследованияЭксперименты проведены на 104 белых беспородных крысах-самцахмассой 180-220 г. Животных подвергали однократному общему воздей-ствию рентгеновского излучения на аппарате РУМ-17 в дозе 5,5 Гр (напря-жение 220 кВ, сила тока 15 мА, фильтры 0,5 мм Cu + 1 мм Al, фокусноерасстояние 60 см). После облучения опытным животным вводили абисиб(производство ООО НПЦ «БИОЭПЛ», Томск), 0,1%-ный водный растворхитозан-гидрохлорида с ММ 23 кДа (производство ВНИТИ биологическойпромышленности, Щелково) и 0,1%-ный раствор хитозана в абисибе - хи-табис. Препараты в объеме 1 мл вводили перорально через зонд непосред-ственно сразу после облучения и затем в течение 10 дней. Контрольные жи-вотные получали по 1 мл дистиллированной воды в эти же сроки.На 7, 14 и 26-е сут после облучения животных показатели перифериче-ской крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина)оценивали по стандартным клиническим методикам. Клеточность костногомозга определяли, вымывая костный мозг из бедренной кости и рассчитываяколичество клеток на бедро.Структурно-функциональное состояние пристеночного надэпителиаль-ного слизистого слоя (НэСС) тонкого кишечника исследовали в соответ-ствии с модифицированной методикой Н.А. Кривовой [18]. Нативную слизьсо стенок тонкого кишечника подвергали очистке, в результате которойполучали фракцию очищенных гликопротеиновней арифметической с ошибкой. Статистическую значимость различий междусравниваемыми выборками показателей оценивали с помощью непараметри-ческого U-критерия Манна - Уитни с уровнем значимости р < 0,05 [23].Результаты исследования и обсуждениеРезультаты исследований показали, что облучение крыс в дозе 5,5 Гр(контрольная группа) приводило к выраженным и стойким изменениям кар-тины периферической крови, вызванным, главным образом, опустошениемкроветворных органов (табл. 1).Т а б л и ц а 1Показатели периферической крови и клеточности костного мозгакрыс, облученных в дозе 5,5 Гр, после 10-дневного введения абисиба,хитозана, хитабисаВремяпослеоблу-ченияГруппаКоличествоэритроцитов,× 1012/лКоличестволейкоцитов,× 109/лСодержаниегемоглобина,г/лКлеточностькостного мозга,× 106/бедро- Интактныйконтроль n = 10 6,00 ± 0,22 13,19 ± 0,86 142,1 ± 6,6 108,75 ± 5,167-е сутКонтроль(облучение) n = 8 4,49 ± 0,04* 0,95 ± 0,06* 144,0 ± 9,0 72,40 ± 3,47*Облучение +абисиб n = 83,81 ±0,11* /** 1,29 ± 0,04* /** 115,6 ±6,0* /** 66,96 ± 6,09*Облучение +хитозан n = 83,07 ±0,21* /** 1,20 ± 0,03* /** 116,4 ±6,6* /** 69,56 ± 3,07*Облучение +хитабис n = 8 4,80 ± 0,19* 1,58 ± 0,08* /** 152,9 ± 7,8 56,16 ±3,07* /**14-е сутКонтроль(облучение) n = 8 2,96 ± 0,28* 1,36± 0,11* 85,5 ± 10,1* 58,70±3,10*Облучение +абисиб n = 8 2,64 ± 0,20* 1,99 ± 0,27* /** 70,8 ± 6,1* 60,76±6,33*Облучение +хитозан n = 8 3,70 ± 0,25* 2,31 ± 0,28* /** 114,1 ±4,7* /**82,50 ±2,61* /**Облучение +хитабис n = 8 3,68 ± 0,32* 2,77 ± 0,32* /** 101,4 ± 8,4* 80,72 ±9,81* /**26-е сутКонтроль(облучение) n = 7 4,40 ± 0,07* 4,14 ± 0,34* 130,7 ± 1,7 117,26 ± 1,79Облучение +абисиб n = 83,69 ±0,23* /** 3,28 ± 0,48* 152,5±5,1** 103,96 ±1,47**Облучение +хитозан n = 83,61 ±0,15* /** 3,09 ± 0,16* /** 123,7 ± 1,5* 97,86 ± 3,67**Облучение +хитабис n = 73,38 ±0,09* /** 3,78 ± 0,33* 127,7 ± 3,6 109,66 ±5,52*** Статистически значимые отличия показателей от интактного контроля (р < 0,05).** Статистически значимые отличия показателей от соответствующего облученного кон-троля (р < 0,05).На 7-е сут после облучения наблюдали ярко выраженную лейкопению(количество лейкоцитов было в 14 раз ниже, чем у интактных животных),которая сохранялась на 14-е и 26-е сут после облучения. Несмотря на точто клетки эритроцитарного ряда также высокорадиочувствительны [24],количество эритроцитов снижалось медленнее, что связано прежде всего сбольшим сроком жизни красных кровяных телец. Наименьшее содержаниегемоглобина и эритроцитов отмечено на 14-е сут после облучения: к этомувремени количество эритроцитов составило 50%, а содержание гемоглоби-на - 60% от интактного уровня. Также отмечено максимальное опустошениекостного мозга (клеточность костного мозга в 2 раза ниже, чем в интактнойгруппе животных). К 26-м сут клеточность костного мозга восстанавлива-лась до интактного уровня, повышалось содержание эритроцитов и гемогло-бина в крови облученных крыс.Действие абисиба, хитозана, хитабиса, вводимых в течение 10 дней по-сле облучения, проявляется на показателях красного кровяного ростка в раз-ные сроки после облучения. На 7-е сут после применения абисиба и хитоза-на отмечено достоверное снижение количества эритроцитов и содержаниягемоглобина облученных животных, при введении хитабиса не выявленостатистически значимых различий между опытной и контрольной группами(см. табл. 1). В разгар лучевой болезни (14-е сут) количество эритроцитови содержание гемоглобина были наименьшими по сравнению с интактнымконтролем как в опытных группах, так и в контрольной. У животных, полу-чавших хитозан, в этот срок содержание гемоглобина в крови было досто-верно выше, чем у соответствующего облученного контроля. На 26-е сут по-сле облучения количество эритроцитов во всех опытных группах сниженопо сравнению с показателями как интактного, так и облученного контроля.В этот срок отмечено достоверное увеличение гемоглобина в перифериче-ской крови у крыс, получавших абисиб (см. табл. 1). Гемостимулирующеедействие абисиба в восстановительный период острой лучевой болезни(ОЛБ) было зарегистрировано также в исследованиях Н.Я. Костеши [25] иЗ.К. Вымятниной и др. [26]. Авторы связывают данный эффект с влияниемабисиба на интенсификацию процессов регенерации в костном мозге и уси-ление функциональной активности щитовидной железы, играющей важнуюроль в постлучевом восстановлении организма.Таким образом, хитозан проявляет гемостимулирующее действие в разгарлучевой болезни (14-е сут после облучения), а абисиб - в восстановительныйпериод (26-е сут после облучения), что, безусловно, сказывается на исходе ОЛБ.В группах животных, получавших хитозан и абисиб, наблюдали боль-шую сохранность лейкоцитов, чем в контрольной группе облученных крыс.Еще более выраженный эффект отмечен у крыс, получавших хитабис. Так,на 7-е сут после облучения число лейкоцитов периферической крови в опыт-ной группе было в 1,5 раза больше, чем в контрольной, а на 14-е сут послеоблучения - более, чем в 2 раза. К концу наблюдения разница в содержаниилейкоцитов нивелировалась (см. табл. 1).В разгар лучевой болезни (14-е сут), когда клеточность костного мозгав контрольной группе составила 54% от интактного контроля, у животных,получавших хитабис, этот показатель снижался лишь до 74% от интактногоконтроля (см. табл. 1). Клеточность костного мозга у крыс, получавших аби-сиб, практически не отличалась от контрольных, тогда как в группе, полу-чавшей хитозан, составляла 76% от интактного контроля, что на 22% вышеуровня этого показателя у контрольных облученных животных.Анализ полученных результатов позволяет заключить, что для всех группоблученных животных наиболее характерными изменениями в системе ге-мопоэза можно считать опустошение костного мозга, лейкопению, а в болеепоздние сроки - эритропению.Количественные изменения со стороны форменных элементов пери-ферической крови после облучения отражают процессы, происходящиев костном мозге, функциональные и репаративные особенности каждогоклеточного пула. Клеточность костного мозга наиболее адекватно характе-ризует степень лучевого поражения организма [27]. В наших эксперимен-тах через 7 дней после облучения отмечено существенное снижение кле-точности костного мозга (до 66% от интактного контроля). Минимальноезначение клеточности костного мозга у облученных крыс зарегистрированочерез 2 недели (50% от интактного контроля). Процессы регенерации кро-ветворных клеток в контрольной группе животных отмечены на 26-е сутпосле облучения. В группах животных, получавших хитозан и хитабис,процессы восстановления начинались раньше (через 2 недели после об-лучения) и были более выражены. Это может быть связано как с усиле-нием пролиферативной активности выживших стволовых клеток, так и смиграцией в костный мозг клеток (в первую очередь лимфоцитов) из пери-ферической крови и тимуса. Исследованиями К.Д. Жоголева и соавт. [28]показано, что хитозан стимулирует процессы миграции, пролиферации идифференцировки стволовых гемопоэтических клеток, способствуя болеебыстрой репарации костного мозга облученных животных. Таким образом,введение хитозана после облучения оказывает противолучевое действие,проявляющееся в увеличении содержания гемоглобина и количества лейко-цитов в периферической крови, клеточности костного мозга опытных крыспо сравнению с соответствующими показателями у контрольных животныхв разгар лучевой болезни. Абисиб проявляет гемостимулирующее действиев восстановительный период. Противолучевая активность комплексногопрепарата хитабис наиболее выражена по отношению к белому кровяномуростку в разгар лучевой болезни и является результатом синергизма его от-дельных компонентов.Известно, что кроветворная и пищеварительная системы, в частноститонкий кишечник, являются наиболее радиочувствительными системамиорганизма. Структурно-функциональное состояние тонкого кишечника от-ражает степень лучевого поражения организма [29]. Структурные Гп НэССобладают протекторными свойствами благодаря вязкости и эластичностиформируемого геля, а продукты распада ГП обладают антирадикальнойактивностью, по-видимому, благодаря большому числу свободных радика-лов на моносахаридных остатках [30]. Выполнение основной функции Гпслизи - образование слизистого геля - определяется строением боковыхолигосахаридных цепочек молекулы [31]. Благодаря присутствию олигоса-харидов гликозилированные участки полипептидов недоступны протеолизу.В Гп НэСС желудочно-кишечного тракта присутствуют следующие моно-сахара: ацетил-Д-глюкозамин, ацетил-Д-галактозамин, галактоза, фукоза иацетилнейраминовая (сиаловая) кислота [32].Облучение крыс в дозе 5,5 Гр приводило к снижению в слизи (струк-турные ГП) фукозы и галактозы во все сроки наблюдения (табл. 2), чтосвидетельствует о происходящих в облученном кишечнике деструктивныхпроцессах. Подобный эффект отмечен во всех экспериментальных груп-пах, за исключением животных, получавших хитозан. В этой группе на14-е и 26-е сут после облучения содержание фукозы и галактозы было до-стоверно выше, чем у контрольных облученных животных, что являетсясвидетельством активных репаративных процессов, происходящих в ки-шечнике. Содержание гексозаминов на 7-е сут после облучения оставалосьнеизменным, кроме группы крыс, получавших хитозан. На 14-е и 26-е сут вовсех экспериментальных группах содержание гексозаминов было сниже-но по сравнению с соответствующим показателем у интактного контроля.Лишь в группе крыс, получавших абисиб, содержание гексозаминов былодостоверно выше соответствующего показателя у облученного контроля ипочти приближалось к значению интактного контроля. У животных, полу-чавших хитабис, наблюдали увеличение фукозы и галактозы, при неболь-шом снижении гексозаминов, на 14-е сут после облучения. На 26-е сутпосле воздействия зарегистрированы небольшое снижение галактозы иувеличение нейраминовой кислоты в слизи кишечника крыс, получавшиххитабис (табл. 2).Защитную функцию слизи косвенно характеризует суммарное содержа-ние моносахаров структурных Гп [33]. Резкое снижение концентрации мо-носахаров при облучении указывает на ослабление защитной функцииТ а б л и ц а 2Состав структурных гликопротеинов пристеночного слизистого слоятонкого кишечника крыс, облученных в дозе 5,5 ГрГруппаГексоза-мины,мкмоль/млГалактоза,мкмоль/млФукоза,мкмоль/млНейрами-новаякислота,мкмол/млСуммамоноса-харов,мкмоль/млИнтактныйконтроль n = 10 5,31 ± 0,81 23,3 ± 4,0 18,1 ± 5,3 0,966 ± 0,133 47,7 ± 5,27-есутКонтроль(облучение)n = 85,30 ± 0,30 14,43 ± 1,11* 7,21 ± 1,18* 0,999 ± 0,004 27,9 ±1,16*Облучение +абисиб n = 8 5,60 ± 0,21 14,71± 1,49* 5,62 ± 0,63* 0,866 ± 0,100 26,8 ±1,46*Облучение +хитозан n = 84,20 ±0,25*/**8,38 ±0,97*/** 11,41 ± 2,07 1,099 ± 0,230 25,1 ±2,01*Облучение +хитабис n = 8 5,30 ± 0,21 16,71 ± 1,63* 9,62 ± 1,76* 1,265 ± 0,110 32,6 ±1,60*/**14-есутКонтроль(облучение)n = 83,75 ± 0,21 7,05 ± 0,69* 2,77 ± 0,23* 1,216 ± 0,180 14,8 ±0,50*Облучение +абисиб n = 84,93 ±0,38** 8,49 ± 1,30* 3,65 ± 0,30* 1,485 ± 0,110 18,6 ±1,20*/**Облучение +хитозан n = 83,07 ±0,15*/**14,21 ±2,38* /**3,93 ±0,26*/**1,698 ±0,180*22,9 ±2,20*/**Облучение +хитабис n = 8 3,25 ± 0,10* 10,66 ±1,31*/**4,12 ±0,16*/** 1,375 ±0,070 19,4 ±1,30*/**26-есутКонтроль(облучение)n = 73,39 ± 0,15* 8,38 ± 1,17* 4,46 ± 0,51* 1,399 ± 0,100 17,6 ±1,10*Облучение +абисиб n = 8 3,25 ± 0,14* 9,27 ± 0,94* 4,03 ± 0,31* 1,765 ±0,030*/**18,3 ±0,80*Облучение +хитозан n = 8 3,35 ± 0,34* 43,0 ±3,32*/**12,42 ±0,58**0,902 ±0,100**59,7 ±3,20**Облучение +хитабис n = 7 2,71 ± 0,27* 5,00 ±0,34*/** 4,69 ± 0,55* 1,775 ±0,120*/**14,2 ±0,30** Статистически значимые отличия показателей от интактного контроля (р < 0,05).** Статистически значимые отличия показателей от соответствующего облученного кон-троля (р < 0,05).Для характеристики строения олигосахаридных цепочек структурныхГп было рассчитано парциальное содержание отдельных моносахаров. Из-вестно, что основной функцией структурных Гп НэСС является образованиеслизистого геля, который образуется за счет нековалентных взаимодействиймежду гликозилированными участками разных молекул Гп [34, 35]. Этивзаимодействия осуществляются благодаря терминально расположеннымостаткам фукозы и нейраминовой кислоты, а также наличию дисульфидныхсвязей [30]. По количеству терминально расположенных фукозы и нейра-миновой кислоты, по-видимому, можно судить об устойчивости слизистогогеля к разрушению. Суммарное содержание терминальных моносахаров уинтактных животных составляет 40% в общем пуле углеводных компонен-тов слизи. Увеличение или уменьшение их процентного содержания можетсвидетельствовать об увеличении или уменьшении защитных свойств НэССтонкого кишечника.Облучение контрольных животных приводит к изменению парциальногосостава углеводных компонентов олигосахаридных цепочек Гп. Суммарноесодержание фукозы и нейраминовой кислоты снижается как в облученномконтроле, так и после применения абисиба.Введение хитозана и хитабиса существенно изменяет соотношение угле-водных компонентов слизи по сравнению с соответствующими показателямиу облученного контроля. На 7-е сут после облучения у животных, получав-ших хитозан, суммарное содержание терминальных углеводных компонен-тов составляет 49,9%, что превышает их содержание в интактном контроле,а на 14-е и 26-е сут оно значительно снижено (до 24,6 и 22,3% соответствен-но). Такая динамика, вероятно, связана с тем, что защитное действие хитоза-на проявлялось только в период введения препарата (10 сут). По-видимому,этот эффект можно объяснить сорбционными свойствами хитозана и малымего проникновением из ЖКТ в кровоток. Большое количество водородныхсвязей, которые способен образовывать хитозан, определяют его способ-ность связывать большое количество органических водорастворимых ве-ществ, в том числе бактериальные токсины и токсины, образующиеся вкишечнике в процессе пищеварения. Первичные аминогруппы хитозанаобеспечивают связывание ионов тяжелых металлов и радионуклидов, в де-сятки раз превосходя по эффективности ионообменные смолы [36].При введении хитабиса суммарное содержание концевых углеводныхкомпонентов во все сроки наблюдения выше, чем соответствующие показа-тели в облученном контроле, и на 26-е сут составляет 45,5% по сравнениюс 33,2% в облученном контроле. Полученные данныев деструкции хитозана, что в свою очередь может приводить к частичномуего усваиванию [37]. Во-вторых, хитозан, поступая в желудочно-кишечныйтракт вместе с экстрактом фитосбора, может активизировать ферменты че-ловека типа хитотриозидаз [38] лизоцима. Кроме этого, хитозан может раз-рушаться Н2О2 и активными формами кислорода [39], особенно если в хи-тозансодержащем фитопрепарате имеется повышенное содержание железа,меди и других металлов с переменной валентностью. Абисиб представляетсобой многокомпонентную систему, содержащую витаминные комплексы,органические кислоты [40], макро- и микроэлементы. Среди макроэлемен-тов обнаружено наибольшее количество магния (1,7 г/л), калия (0,6 г/л), на-трия (0,3 г/л), железа (19,8 мг/л) и цинка (4,2 мг/л); рН абисиба находитсяв пределах 2,6-4,6 [25]. Все это может приводить к расщеплению хитозанапо β-(1-4)-гликозидной связи и накоплению легко усвояемой олигомернойфракции хитозана [39].Таким образом, введение хитозана крысам после облучения способствуетповышению защитных свойств НэСС тонкого кишечника путем формирова-ния более устойчивого к разрушению слизистого геля тонкого кишечника на7-е сут после облучения и увеличения суммарного содержания структурныхгликопротеинов в разгар лучевой болезни и в восстановительный период.Курсовое применение хитабиса также повышает защитные свойства НэССтонкого кишечника путем формирования более устойчивого к разрушениюслизистого геля тонкого кишечника в течение всего периода наблюдения (7,14, 26-е сут после облучения крыс в дозе 5,5 Гр).Под действием радиации активируется свободнорадикальное окисление,нарушается деятельность быстро обновляющихся тканей, в частности систе-мы кроветворения и желудочно-кишечного тракта, выработка антиоксидант-ных факторов этими органами подавляется, и устойчивость эксперименталь-ных животных резко снижается [41]. Поэтому введение веществ, которыемогут выступать перехватчиками образующихся под действием ионизирую-щего излучения радикалов, должно способствовать снижению поражающегодействия радиацииРис. 1. Схема патогенеза костномозговой формы острой лучевой болезни с указанием возможных путей воздействия абисиба, хитозана, хитабисаИонизирующеемональную регуляцию. В ранее проведенных исследованиях показано уси-ление синтетических процессов в аденогипофизе, снижение гиперсекрециикоркового слоя надпочечников [25]. Формирование определенных взаимос-вязей в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе под влияниемабисиба способствует включению защитных механизмов, определяющихрезистентность организма к радиационному воздействию. Для кроветвор-ной системы это проявляется в большей сохранности костного мозга, длягастродуоденальной системы - более ранним развитием репаративных про-цессов в слизистой тонкого кишечника и формированием устойчивого сли-зистого слоя.Более выраженная противолучевая активность хитабиса по сравнениюс его компонентами может быть связана с влиянием абисиба на изменениединамики распределения и содержания хитозана в крови и различных орга-нах опытных животных. Гетерогенность комплексного препарата (хитабис)дает увеличение противолучевого действия - гемо- и иммуностимулирую-щее действие абисиба усиливается сочетанием с сорбционными свойствамихитозана. Полученные результаты позволяют сделать заключение о выра-женном противолучевом действии комплексного препарата хитабис.

Скачать электронную версию публикации