Influence of brassinosteroids on forming protective reactions in rape seedlings under salinity.pdf Введение Суша Земли составляет 13,2 109 га, среди которых только 7109 га приходится на пахотные почвы и 1,5 109 га - на целинные [1]. По состоянию на 2005 г. почти третья часть пахотных и целинных земель была засолена [2]. Причины засоления почв различны: начальное засоление материнской породы, наступление морской воды на прибрежные районы, использование соленой воды в аграрном производстве, ограниченный дренаж, низкий уровень осадков и высокая интенсивность испарения [1]. Последствия почвенного засоления проявляются в снижении продуктивности агро- и биоценозов, в падении биоразнообразия и экономических потерях, особенно серьезных для тех стран, экономика которых напрямую зависит от объема сельскохозяйственного производства [3]. Губительное воздействие засоления на растения обусловлено падением водного потенциала почвенного раствора, что снижает доступность воды для корневой системы, увеличением внутриклеточной концентрации ионов, оказывающих токсический эффект на метаболизм растений, и изменением структуры почвы, что способствует снижению ее водопроницаемости и аэрации [1]. Одним из потенциальных способов защиты растений от хлоридного засоления может быть их обработка фитогормонами, среди которых наибольший интерес представляют брассиностероиды, обладающие рядом преимуществ перед другими гормонами. В научной литературе широко обсуждается способность брассиностероидов регулировать рост и развитие растений в процессе онтогенеза. Известно, что они изменяют активность ферментов, мембранный потенциал, активируют синтез белков и нуклеиновых кислот, регулируют метаболизм аминокислот и жирных кислот, влияют на гормональный статус растительного организма, тем самым стимулируя растяжение и деление клеток [4-9] и, как следствие, усиление роста растения и повышение его продуктивности [10-12]. Среди преимуществ брассино-стероидов можно отметить их экологическую безопасность и способность вызывать эффекты в чрезвычайно низких концентрациях, по сравнению с другими гормонами. Механизмы стресс-протекторного действия стероидных фитогормонов остаются в настоящее время практически не исследованными [13]. В данной работе проведен анализ возможной защитной роли брасси-ностероида эпибрассинолида при хлоридном засолении. Эффект гормона оценивали по его способности снижать негативное влияние высокой концентрации NaCl на прорастание семян, накопление фотосинтетических пигментов, содержание пролина и развитие проростков рапса. Материалы и методики исследования Исследования проводили на проростках рапса Brassica napus L. сорта Ве-стар. Изучали негативный эффект, вызываемый высокой концентрацией NaCl (175 мМ) на морфогенез, и некоторые физиологические показатели проростков на белом свету (плотность потока падающих квантов - 170 мкмоль/м2с; фотопериод 16/8 чч, температура воздуха 22±2°С). В качестве контроля использовали 7-суточные проростки, выращенные на дистиллированной воде. Ростовые показатели проростков (длина гипокотиля и корня), содержание фотосинтетических пигментов и пролина анализировали на 7-е сут от начала прорастания семян в условиях засоления. Для изучения защитного действия брассиностероидов при хлоридном засолении семена рапса проращивали на растворе эпибрассинолида (10-10 и 10-8 М). Эпибрассинолид (ЭБЛ) был любезно предоставлен чл.-кор. НАН Беларуси В.А. Хрипачем (лаборатория химии стероидов Института биоорганической химии НАН Беларуси, Минск), за что авторы выражают ему искреннюю благодарность. Экстракцию и определение свободного пролина проводили по модифицированному методу Bates et al. [14]. Растительный материал (100-200 мг сырой массы) растирали в жидком азоте, переносили в пробирку Эппендор-фа и доводили дистиллированной водой до метки 2 мл. Пробирку помещали в термостат на 30 мин при температуре 99°С. Часть вытяжки (250 мкл) переносили в мерные пробирки, доливали 750 мкл дистиллированной воды, добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл нингидринового реактива и инкубировали в течение 1 ч на кипящей водяной бане. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Genesys 20, ThermoElectron, Германия) при длине волны 520 нм. Содержание пролина рассчитывали по формуле С = £•£• V/m 1000, где C - концентрация пролина, мкмоль/г сырой массы; E - оптическая плотность; к - коэффициент; V- объем экстракта, мл; m - масса навески, г. Для оценки уровня фотосинтетических пигментов семядоли проростков растирали в 96%-ном этаноле и полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 8 тыс. об./мин (центрифуга MiniSpin, Eppendorf, Германия). Оптическую плотность раствора измеряли на спектрофотометре (Genesys 10, ThermoElectron, Германия). Концентрацию пигментов в спиртовой вытяжке рассчитывали согласно [15]. Длину гипокотилей и корней проростков рапса измеряли под лупой БМ-51-2 (КОМЗ, Казань). Для каждого варианта брали пробы в 2-3 биологических повторностях, каждая из которых содержала по 15 проростков. Эксперименты проводили не менее трех раз. Результаты экспериментов представлены на рисунках в виде средней арифметической со стандартной ошибкой. Для сравнения независимых выборок, подчиняющихся закону нормального распределения, использовали параметрический критерий Стьюдента. Значения t-критерия находили для 95%-го уровня значимости (р < 0,05). Результаты исследования и обсуждение Засоление тормозит рост растений и снижает их продуктивность. Отрицательное воздействие засоления обусловлено низким водным потенциалом почвенного раствора, токсичностью ионов и дисбалансом питательных элементов [16]. Наиболее губительный эффект NaCl оказывает на ранних этапах развития растений. Из рис. 1 видно, что число проросших семян в присутствии 175 мМ NaCl составило 30% от контрольного варианта. Внешний вид проростков также претерпевал значительные изменения. Засоление значительно подавляло рост зародышевого стебля (гипокотиля) и корня. Наибольшая чувствительность к действию NaCl на белом свету, в отличие от темноты [17, 18], была отмечена для корня, рост которого был подавлен в 5 раз по сравнению с контролем (рис. 2). V 1 л "я н * • Контроль о «*•* * * - щ ■ 1 ЭБЛ-10 г ^ 1 ЭЕЛ-S с . * •/ Nad. •Л' * • NaCl+ ЭЙС-10 m ч У' ■ Ч Nad + ЭБЛ-S Рис. 1. 7-суточные проростки рапса. Здесь и далее ЭБЛ-10 и ЭБЛ-8 - эпибрассинолид в концентрации 10-10 и 10-8 М соответственно ■ * * ■ 20 0 * NaCl ЭБЛ-10 ЭБЛ-8 NaCl + ЭБЛ-10 NaCl + ЭБЛ-8 Игипокотиль □ корень Рис. 2. Влияние экзогенного эпибрассинолида на ростовые показатели проростков рапса при засолении. Звездочкой отмечены статистически значимые отличия от контроля (р < 0,05) Экзогенный ЭБЛ (10-10 или 10-8 М) значительно снижал негативный эффект засоления на прорастание семян и рост гипокотиля. При этом его длина была в два раза больше длины гипокотиля проростков, выращенных на растворе с NaCl, но в 2 раза меньше длины гипокотилей контрольных проростков (без стрессового воздействия) (рис. 2). Протекторный эффект гормона для зародышевого корня носил концентрационную зависимость. Наибольшее защитное действие при засолении проявлял ЭБЛ в концентрации 10-8 М. В этом случае длина корня была в 4 раза больше по сравнению с длиной корня проростков, подвергнутых действию только 175 мМ NaCl. Контроль Содержание фотосинтетических пигментов при хлоридном засолении снижалось примерно в два раза (рис. 3), а соотношение хлорофиллов (a+b) к каротиноидам - в 1,5 раза, несмотря на то что соотношение хлорофиллов к каротиноидам при обработке семян ЭБЛ не изменялось. Причина такой стабильности зависела от действующей концентрации гормона. В то время как низкая концентрация ЭБЛ (10-10 М) не приводила к значительному увеличению уровней хлорофиллов и каротиноидов, высокая его концентрация способствовала повышению содержания хлорофилла а в 2 раза и других пигментов (хлорофилла b и каротиноидов) - в 1,5 раза. Отсутствие видимых изменений в уровнях фотосинтетических пигментов при обработке растений ЭБЛ в низкой концентрации не может свидетельствовать о том, что фотосинтетическая активность растений осталась неизменной. На данный момент показано, что в зависимости от действующей концентрации брас-синостероиды изменяют интенсивность транскрипции пластидного генома Arabidopsis, ячменя и рапса [7, 8, 19]. При засолении выраженный протекторный эффект был показан для высокой концентрации ЭБЛ (10-8 М). Наблюдаемое частичное восстановление уровней фотосинтетических пигментов до контрольного происходило за счет повышения содержания хлорофилла а и каротиноидов (рис. 4). Известно, что засоление вызывает водный дефицит у растений. Поддержание оптимального водного статуса и интактной структуры макромолекул при стрессе является одним из необходимых условий выживания растений. На клеточном уровне метаболизм растений изменяется таким образом, чтобы предотвратить негативные последствия повреждающего действия стрес-сорных факторов. Достигается это путем индукции синтеза макромолекул с новыми свойствами или путем оптимизации внутриклеточной среды функционирования ферментных систем за счет накопления органических совместимых осмолитов с протекторными и/или осморегуляторными свойствами [20]. В основе формирования этих механизмов адаптации лежит дифференциальная экспрессия генов, зависящая от интенсивности и продолжительности действия стрессоров, а также от онтогенетического состояния растений [21]. При адаптации растений к водному дефициту ключевая роль принадлежит совместимым низкомолекулярным органическим осмолитам - аминокислотам, сахарам, сахаро-спиртам и бетаинам [22-25]. Аминокислота пролин является универсальным совместимым осмолитом высших растений. Свободный пролин при стрессе обладает полифункциональным биологическим эффектом, который проявляется в осморегуляторной, анти-оксидантной и энергетической функциях; помимо этого, пролин выступает в качестве химического шаперона [21]. Рис. 3. Влияние экзогенного эпибрассинолида на уровень фотосинтетических пигментов при засолении На рис. 4 показано, что на хлоридное засоление проростки рапса отвечали 70-кратным увеличением содержания пролина. Экзогенный эпибрасси-нолид в 7-10 раз снижал NaCl-индуцированную аккумуляцию пролина; при этом наибольший эффект достигался при высокой концентрации гормона (рис. 4). Рис. 4. Влияние экзогенного эпибрассинолида на содержание пролина при засолении При формировании защитных механизмов на фоне хлоридного засоления важным является не только быстрое обеспечение растения высокими концентрациями совместимых осмолитов, но и сохранение энергетических ресурсов за счет блокирования отдельных метаболических путей и формирования альтернативных защитных систем, направленных на выживание организма в условиях стресса. В нашем случае ЭБЛ повышал солеустойчивость проростков рапса и одновременно снижал уровень пролина при засолении. Отсюда следует, что защитный эффект гормона не мог быть опосредован протекторным эффектом пролина. Весьма вероятно, что при засолении ЭБЛ индуцировал синтез антиок-сидантных ферментов, которые в данном случае оказались эффективнее пролина как антиоксиданта, что и проявилось в снижении интенсивности его аккумуляции. Более того, в настоящее время установлено, что характер отношений между активностью антиоксидантных ферментов и уровнем низкомолекулярных антиокисдантов (например, пролина) при стрессе является реципрокным [25]. Другая возможная причина защитного эффекта ЭБЛ в условиях засоления может заключаться в гормон-зависимом изменении кальциевого го-меостаза. Известно, что в основе устойчивости растений к хлоридному засолению лежит не только осмоустойчивость, но и способность растения исключать Na+ или проявлять резистентность тканей к Na+ [26]. Центральным процессом в этих механизмах является транспорт воды и ионов Na+, K+ и Cl-. Транспорт ионов натрия зависит от концентрации кальция внутри и вне клетки [27]. С другой стороны, натрий снижает поступление и усиливает выход кальция через мембраны, что приводит к истощению запасов этого элемента в клетке [28]. Кроме того, есть данные, согласно которым снижение внутриклеточной концентрации кальция при хлоридном засолении увеличивает уровень пролина за счет снижения активности пролин оксидазы и повышения у-глутамилкиназной активности в семядолях и зародышевой оси проростков арахиса [29]. Возможно, снижение токсического эффекта хлоридного засоления на растения брассиностероидами может быть связано с привлечением ионов кальция в цитоплазму клеток не только из внутриклеточных пулов, как это делают ауксины и гиббереллины, но и из апопласта [30]. Тем более экспериментально установлено, что введение ионов кальция в питательную среду или обработка растворами солей кальция засоленных территорий сопровождаются повышением солеу-стойчивости растений. Заключение Исследование влияния хлоридного засоления на развитие проростков рапса показало, что наряду с подавлением роста осевых органов солевой стресс снижает уровень фотосинетических пигментов и повышает содержание пролина. Выявлена высокая солезащитная активность эпибрассинолида на прорастание семян, рост проростков, накопление фотосинетических пигментов. Обсуждаются возможные механизмы стресс-протекторного действия эпибрассинолида при засолении.

Скачать электронную версию публикации