Effect of long-term geomagnetic field weakening on aggressiveness of rats and opioidergic neurons activation.pdf Введение Эволюция биосферы всегда протекала в условиях геомагнитного поля, однако мы пока очень немного знаем о конкретных механизмах его влияния на организм. Одним из методов, позволяющих понять механизмы действия на организм какого-либо постоянно действующего фактора среды, являет- ся модель, в которой это влияние отсутствует. В данном случае речь идет о создании условий ослабленного геомагнитного поля, т.е. гипомагнитной среде (ГМС). Кроме того, гипомагнитная среда является моделью пребыва- ния человека в дальнем космосе, при межпланетных перелетах, в условиях Луны и Марса, где уровень магнитного поля (МП) в сотни раз меньше, чем на Земле [1]. Однако и на Земле имеются условия, в которых ГМП существенно ослаблено: в метро, при полете на самолетах, на производстве в экранированных сооружениях, в железобетонных подземных сооружениях, военной технике [2, 3]. Гипогеомагнитные условия моделируют с помощью экранирования ГМП, которое создается с помощью материалов с высокой магнитной проницаемостью (ц-металл, пермаллой), либо компенсации [4-9]. Компенсация ГМП создается системой колец Гельмгольца, расположенных во взаимно перпендикулярных плоскостях. По этим кольцам проходит ток, величина которого рассчитывается так, чтобы МП, образующееся в результате индукции, компенсировало колебания сверхнизкочастотных электромагнитных полей. Именно этот вид создания гипогеомагнитных условий получил наибольшее распространение в исследованиях [5, 6, 8-14]. Экспериментальных работ, посвященных изучению влияния ослабленного ГМП на целостный организм, и тем более на организм млекопитающих, немного. В исследованиях на человеке показано, что снижение ГМП или создание переменного магнитного поля изменяло критическую частоту мелькания, период циркадных ритмов [4], ухудшало выполнение когнитивных заданий [12], память и снижало время реакции [10, 11]. Исследования на животных показали, что ослабление ГМП может вызывать уменьшение антиноцицептивных ответов [5, 6], ингибировать норадренергическую систему [14], ухудшать процессы консолидации памятного следа [8, 9], а также связано с более быстрым привыканием к новым стимулам [15]. В работе [9] показано, что наиболее вероятными структурами мозга, связанными с магниторецепцией, являются структуры среднего мозга [8, 9], в частности верхние бугорки четверохолмия [9] и дорсальные ядра покрышки [8]. Таким образом, влияние снижения ГМП на центральную нервную систему показано в значительном числе работ. Однако во всех работах экспозиция лабораторных животных (а в некоторых экспериментах и людей) была либо однократной, либо ежедневной в течение 5-10 дней, но составляла всего 11-120 мин в день. Снижение ГМП в течение длительного времени (суток, недель, месяцев) является более адекватным при моделировании одного из факторов космического полета. Проведенные нами эксперименты, где в качестве объектов исследования были использованы лабораторные крысы, показали выраженное нейротропное действие при длительном (в течение 25 и 10 сут) снижении ГМП [16]. В недавнем исследовании показаны снижение общей двигательной активности и изменения ЭЭГ при ослаблении геомагнитного поля в течение 21 сут. В настоящем исследовании отражено влияние ослабления ГМП в течение 21 сут на другие аспекты поведения. В частности, исследовано влияние длительного ослабления ГМП на агрессивность, а также предпринята попытка выяснить механизмы этих изменений с помощью оценки общего уровня нейрональной активации различных структур мозга по белкам раннего ответа c-fos и активацию опиоидергиче-ских нейронов в частности. Этот анализ был выполнен с использованием двойного иммуноокрашивания замороженных срезов мозга крыс, которые подверглись длительному воздействию ГМС в эксперименте. Белок раннего ответа c-fos является продуктом протоонкогена c-fos и признанным маркером активации нейронов [17-20]. Он выполняет функцию регулятора транскрипции ряда индуцибельных генов, формируя комплексы с белками трансфакторами AP-1, NF-AT [17]. Показано, что ген c-fos играет существенную роль в процессах клеточного роста и дифференцировки, а также временно активируется в ответ на воздействия самого широкого спектра [17]. Так, О.Е. Сварник, К.В. Анохин и Ю.И. Александров [20] установили, что данный ген идеально подходит на роль универсального зонда для картирования мозга. В спокойном состоянии клетки он показывает небольшой фоновый уровень активности, но активируется в ответ на какие-либо новые информационные процессы, причем экспрессия c-fos наблюдается в разных отделах центральной нервной системы [17-20]. Материалы и методики исследования Объект исследования. Исследование проводили в осенний период на половозрелых крысах-самцах аутбредного стока Wistar разведения питомника НИИ фармакологии СО РАМН (г. Томск) со средней массой тела 215,7 ± 2,6 г до начала эксперимента. Животных содержали на стандартном пищевом рационе вивария, при свободном доступе к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Схема эксперимента. При поступлении в виварий все крысы (n = 80) были промаркированы. После 7-дневного карантина в условиях вивария 80 крыс были протестированы в «открытом поле» [21], а затем методом кластерного анализа была выделена наиболее однородная группа - 24 крысы со средней двигательной активностью, которые были включены в дальнейшие исследования. Крысы были рассажены в 4 домашние клетки по 6 особей. Две из четырех клеток (n = 12, по 6 особей в каждой клетке) были помещены в условия ослабленного гипомагнитного поля (0 ± 50 нТл) на 21 сут. Еще две клетки с крысами (n = 12, по 6 особей в каждой клетке) составили контрольную группу. Контрольные животные в течение всего эксперимента находились в соседней комнате. Для экспозиции животных в гипогеомагнитной среде была использована специально сконструированная В.П. Сушко и Д.Я. Сухановым камера (рис. 1), позволяющая в автоматическом режиме поддерживать в объеме 50^50x50 см требуемый постоянный уровень магнитного поля с однородностью в пределах 10-7 Тл (± 50 нТл). Компенсация горизонтальной и вертикальной составляющих ГМП осуществлялась с помощью соленоидов -колец Гельмгольца. Соленоиды установлены в каркасе из немагнитных материалов. При этом установка ориентирована так, чтобы третья (одна из горизонтальных) компонента магнитного поля была равна нулю. Величина магнитного поля внутри и снаружи камеры контролировалась магниточувстви-тельными датчиками (ООО «Импеданс»). Сигнал с магнитометра передавался на пульт управления. Расчет силы тока, необходимого для компенсации ГМП, в реальном времени осуществлялся с помощью компьютерной программы. В ходе эксперимента индукция магнитного поля устанавливалась на уровне 0 Тл с колебаниями ± 50 нТл. Через 1,5 ч после пребывания в ГМП все животные были подвергнуты эфирному наркозу и декапитированы. Мозг быстро извлекали, замораживали в парах жидкого азота и помещали в морозильную камеру при -80°C для дальнейшего получения срезов, иммуногистохимического и гистологического окрашивания. Рис. 1. Конструкция и внешний вид камеры: 1 - каркас соленоидов компенсации вертикальной составляющей ГМП; 2 - соленоиды компенсации вертикальной составляющей ГМП; 3 - каркас соленоидов компенсации горизонтальной составляющей ГМП; 4 - соленоиды компенсации горизонтальной составляющей ГМП Анализ агрессивного поведения. В течение всего эксперимента проводилась круглосуточная видеосъемка клеток при помощи камеры с инфракрасной подсветкой. Видеофайлы сохранялись и в дальнейшем анализировались. Анализ видеофайлов проводился путем просмотра видеозаписи всего эксперимента каждые три часа и дополнительно часы смены освещения, т.е. на каждые сутки было получено 10 временных точек (0, 3, 6, 8, 9, 12, 15, 18, 20, 21 ч), просматривался полностью весь час. Во время просмотра видеозаписи фиксировали для каждой группы животных число агрессивных межиндивидуальных взаимодействий. Видеофайлы анализировали «вслепую», т.е. исследователь не был осведомлен о том, опытную или контрольную группу он анализирует. Это было сделано для того, чтобы исключить субъективность при подсчете агрессивных взаимодействий. Иммуноокрашивание. Для выявления механизмов влияния гипогеомаг-нитной среды на агрессивность был проведен дополнительный иммуно-гистохимический анализ срезов мозга двух опытных и двух контрольных животных, включающий двойное иммуноокрашивание: первая флуоресцентная метка - к белкам раннего ответа c-fos, вторая - в ц-опиоидным рецепторам. Поскольку опиоидергическая система имеет непосредственное отношение к болевой чувствительности, мы предположили, что именно изменение болевого порога при воздействии гипогеомагнитной среды [5, 6, 15, 23] является причиной агрессивного поведения животных. В качестве структур мозга были проанализированы: фронтальная кора, верхние бугры четверохолмия, таламус и серое околоводопроводное вещество. Фронтальная кора, как показано в литературе, имеет отношение к агрессивному поведению [24], таламус и околоводопроводное серое вещество - к болевой чувствительности [25], в то же время эти структуры, наряду с серым околоводопроводным веществом, содержат значительное количество клеток, содержащих ц-опиоидные рецепторы. Верхние бугры четверохолмия, как показано в работах [26, 27], характеризуются изменением экспрессии белков раннего ответа под влиянием измененного ГМП. Для окраски срезов применяли так называемый «сэндвич» - метод, использующийся при непрямом выявлении антител и антигенов. Преимуществом данного метода является повышение чувствительности реакции и более интенсивной флуоресценции. Для выявления антигена необходимы две различные сыворотки: немеченая и меченая. Немеченые тела сначала связываются с антигеном, а затем связанные антитела выявляются с помощью меченой сыворотки. Для иммуноокрашивания использовали следующие первичные антитела: 1) Rabbit polyclonal с-fos: sc-52, rabbit anti-rat, Santa Cruz Biotechnology inc.; 2) goat polyclonal MOR-1 (Q-18), Santa Cruz, sc-27072. Используемые вторичные антитела: 1) donkey anti-goat IgG, конъюгированные с Texas Red, Santa Cruz, sc-2783; 2) donkey anti-rabbit IgG (H+L), коньюгированные с Al-exa Fluor® 488, Invitrogen, A-21206. Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ «StatSoft STATISTICA 6.0». При типировании крыс на группы по особенностям нервной системы использовали кластерный анализ, метод К-средних. Статистическая значимость различий агрессивного поведения оценивали с помощью непараметрического критерия парных сравнений Вилкоксона и дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями (факторы «влияние гипомагнитной среды» и «сутки эксперимента»). Для определения уровня нейрональной активации проводился анализ микрофотографий срезов мозга, полученных с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Imager Z1 («Carl Zeiss», Германия). При анализе фиксировались следующие показатели: 1) общее количество клеток по DAPI (синий цвет, ядра клеток); 2) доля клеток, экспрессирующих белки c-fos (зеленый цвет, ассоциированный с ядром), от общего количества клеток; 3) доля клеток, имеющих ц-опиоидные рецепторы (красный цвет, ассоциированный с ядром), от общего количества клеток; 4) доля активированных опиоидергических клеток (сочетание красной и зеленой меток, ассоциированных с ядром) от общего количества опиоидер-гических клеток. Для статистической обработки иммуногистохимического анализа использовались непараметрический критерий Манна - Уитни, ранговый критерий Краскела - Уолисса, а также дисперсионный анализ ANOVA. Статистически значимыми считали различия с уровнем значимости р

Скачать электронную версию публикации