Population genetic structure of honey bee (Apis mellifera L.) in the village of Leboter in Chainskiy district of Tomsk r.pdf Введение Породный состав медоносных пчел Томской области практически не изучался. Предполагается, что с начала XIX в. на территории, которая впоследствии вошла в состав Томской области, культивировалась среднерусская (темная лесная) пчела. По-видимому, пчел неоднократно ввозили переселенцы из центральных и восточных губерний европейской части России. Однако в конце прошлого века для успешного и быстрого решения сельскохозяйственных задач на пасеки Томской области массово стали завозиться южные подвиды пчел с Кавказа. В результате многие семьи пчел на территории области имеют помесное происхождение и уже не обладают ценными качествами среднерусской породы [1]. Настоящая работа является частью комплексного исследования медоносной пчелы, включающего биологическую, хозяйственную и экологическую оценку пчелиных семей в Томской области. Исследования экстерьерных признаков рабочих пчел, проведенные на некоторых пасеках Томской области, показали, что культивируемые пчелы не имеют явной породной принадлежности [2]. Предварительные исследования митохондриального генома медоносных пчел некоторых пасек Томской области подтвердили помесное происхождение пчел на большинстве исследованных пасек [3]. В настоящем сообщении приведены результаты детального исследования пчел пасеки в д. Леботёр Чаинского района Томской области. Данная пасека, выделившаяся из состава крупного пчеловодческого совхоза, является личной и представляет собой типичную пасеку Томской области. Цель исследования заключалась в более полной характеристике гибридных популяций пчел Томской области и оценке информативности морфоме-трических показателей для селекционных работ. Материалы и методики исследования В ходе исследования были изучены комплекс экстерьерных признаков и особенности митохондриального генома рабочих пчел пасеки. Материалом служили рабочие пчелы, полученные с пасеки в д. Леботёр Чаинского района Томской области. Морфометрическими и молекулярно-генетическими методами изучено 54 особи рабочих пчел от 10 пчелосемей. Для молекуляр-но-генетического анализа были использованы образцы ДНК, выделенные из внутренних органов рабочих пчел. Морфометрический анализ. Методами морфометрического анализа измерены длина хоботка и основные параметры правого верхнего крыла. Измерения проводили под бинокулярным микроскопом (МБС) с помощью окуляр-микрометра [2, 4, 5]. Были исследованы три показателя крыла: ку-битальный индекс, или индекс крыла, гантельный индекс и дискоидальное смещение. Для анализа чистопородности пчел наиболее часто используется кубитальный индекс. Этот признак практически не подвергается сезонным изменениям и слабо коррелирует с другими экстерьерными признаками [6]. Результаты морфометрического исследования сравнивались с усредненными экстерьерными признаками рабочих особей разных пород пчел. Статистическая обработка полученных результатов выполнена в программе StatSoft Statistica 6.0. Результаты исследований представлены в виде средних арифметических с ошибкой. Молекулярно-генетический анализ. Для проведения молекулярно-генетиче-ского исследования от каждой пчелиной семьи отбирали по 5-6 рабочих особей, которые хранили в 96%-ном спирте при температуре 4°С. Выделение ДНК из индивидуальных особей проводили модифицированным методом экстракции смесью гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформ [7-9]. Для этого у пчелы выделяли грудные мышцы, которые лизировали в охлажденном буфере, содержащем 4 М гуанидинтиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, 100 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,5% саркозил. Затем к лизату последовательно добавляли 0,1 объема 1 М трис-HCI-буфера (pH 8,0), равный объем водонасыщенного фенола (pH 8,0) и 0,2 объема смеси хлороформ - изоамиловый спирт (24:1) и энергично встряхивали в течение 15 мин. Затем смесь центрифугировали в течение 15 мин при 10000 g. Водно-солевую фазу, содержащую ДНК, осаждали добавлением 2 объемов 96%-ного этанола в присутствии 1/10 части 3 М ацетата натрия. Препарат ДНК выдерживали при температуре -20°C до оформления видимого осадка и центрифугировали 20 мин при 10000g. Осадок, содержащий ДНК, промывали 70%-ным этанолом, высушивали и растворяли в минимальном объеме ТЕ-буфера. Выделенная ДНК анализировалась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, маркирующих межгенный локус цитохромоксидаза I - цитохромоксидаза II (COI-COII) митохондриального генома. Были использованы следующие последовательности праймеров [7]: 3' САСАТТТАGАААТТССАТТА, 5' АТАААТАТАААТСАТGТGGА Полимеразная цепная реакция проводилась согласно описанной методике с модификациями [10]. Реакция проводилась в 20 мкл реакционной смеси, содержащей: 1 мкг ДНК, 2 мкл буфера (10*), 2 мкл MgCl2, 2 мкл смеси ну-клеотидов dNTP, по 10 пМ каждого праймера, 2 единицы ДНК-полимеразы. Условия ПЦР включали первичную денатурацию (95°С), затем следовали 35 циклов, состоящих из денатурации (95°С - 1 мин), отжига праймеров (57°С - 2 мин), элонгации цепи (72°С - 2 мин); реакцию завершала финальная элонгация (72°С - 7 мин). Продукты амплификации фракционировали в I,5%-ном агарозном геле, окрашивали в бромистом этидии, визуализировали в ультрафиолетовом свете и документировали с использованием специальной программы для визуализации гель-электрофореза. Локус COI-COII включает концевые участки генов цитохромоксидазы I и II, ген тРНК и повторяющиеся элементы P и Q, имеющие длину 54 и 196 пар нуклеотидов (п.н.) соответственно (рис. 1). У среднерусской породы медоносной пчелы локус COI-COII включает 3'-конец гена цитохромоксидазы I - ген тРНК - P-элемент - Q-элемент - Q-элемент - 5'-конец гена цитохромоксидазы II (аллель PQQ) и имеет размер 600 пар нуклеотидов. Южные породы пчел (кавказская, карпатская) имеют локус COI-COII размером 350 пар нуклеотидов (аллель Q), включающий 3'-конец гена цитохромоксидазы I - ген тРНК - Q-элемент - 5'-конец гена цитохромоксидазы II (рис. 2). Структура межгенного локуса COI-COII митохондриальной ДНК позволяет установить происхождение пчел по материнской линии [7]. Рис. 1. Схема структуры локуса COI-COII митохондриальной ДНК медоносной пчелы 1 2 3 4 5 Рис. 2. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР со специфическими праймерами для выявления полиморфизма локуса COI-COII мтДНК медоносной пчелы. Дорожки 1 и 2 - образцы ДНК южных пород (размер фрагмента 350 п.н.); 4 и 5 - образцы ДНК среднерусской породы (600 п.н.); 3 - маркер длин фрагментов ДНК (самый яркий фрагмент соответствует 500 п.н.) Результаты исследования и обсуждение Морфометрический анализ. Особи пчел различались по морфометриче-ским параметрам: лишь небольшой процент особей имел экстерьерные признаки, характерные либо для среднерусских пчел (13%), либо соответствовали южным породам пчел (7%). Большинство особей представляло собой помеси с признаками как среднерусской, так и южных пород медоносной пчелы. Длина хоботка исследованных пчел оказалась довольно короткой и составила в среднем 5,61 ± 0,081 мм, т.е. хоботок не соответствует ни среднерусской, ни южным породам медоносной пчелы (табл. 1). Полученные данные согласуются с исследованиями, проведенными ранее на пасеках Томской области [2], согласно которым отличительной особенностью «местных» пчел, характерной как для группы особей с признаками среднерусских, так и для группы помесных, является довольно короткий хоботок. Вероятно, длина хоботка местных пчел определяется прежде всего экологическими условиями их обитания. Возможно, небольшая длина хоботка компенсируется доступностью нектара большинства растений лугов, лесных колков и опушек, составляющих основу кормовой базы пчёл многих пасек. Если результаты измерений длины хоботка однозначно не указывают на породную принадлежность исследуемых пчел, то данные промеров крыла позволяют более точно определить их породную принадлежность. Анализ отдельных морфометрических показателей крыла (кубитальный индекс, гантельный индекс, дискоидальное смещение) у рабочих пчел пасеки д. Ле-ботёр показал, что исследуемые пчелы представляют собой помеси. По величине средних значений кубитального и гантельного индексов, а также дискоидального смещения пчелы пасеки в д. Леботёр соответствуют гибридам среднерусской пчелы с южными расами (табл. 1). Т а б л и ц а 1 Экстерьерные признаки рабочих пчел на пасеке в д. Леботёр Признак Среднее значение признака (n = 54) Минимальное значение признака Максимальное значение признака Длина хоботка, мм 5,61 ± 0,081 4,50 6,50 Кубитальный индекс, % 53,27 ± 1,36 34,62 87,50 Гантельный индекс, отн. ед. 0,864 ± 0,012 0,621 1,016 Представлены вариационные кривые значений кубитального (рис. 3) и гантельного (рис. 4) индексов. Кривая распределения значений кубитально-го индекса всех пчел пасеки отличается от нормального и характеризуется наличием двух «высоких» и двух небольших пиков. Первый «высокий» пик, расположенный между значениями кубитального индекса от 44 до 52%, соответствует южным породам пчел. Второй пик, имеющий границы 54-60%, указывает на наличие на данной пасеке гибридных пчел и влияние южных пород медоносной пчелы. Незначительные пики в зоне значений кубиталь-ного индекса более 60% показывают присутствие на пасеке пчел среднерусской породы. Кривая распределения значений гантельного индекса всех пчел пасеки также отличается от нормального, но характеризуется более плавной кривой с несколькими пиками, соответствующими южным, гибридным и среднерусским пчелам (рис. 4). Вертикальная линия, проходящая через значение 0,923, показывает верхнее значение гантельного индекса для среднерусской породы. Представляет интерес анализ сочетаний исследованных морфологических признаков у пчел пасеки (табл. 2). Из 54 проанализированных особей одновременно все три признака (кубитальный и гантельный индексы, диско-идальное смещение), характерные для среднерусской породы, встречались у 7 особей, что составило приблизительно 13%, тогда как только 4 особи, т.е. 7,4%, имели все исследованные признаки, характерные для южных пород (табл. 2). Преобладало число особей с двумя признаками среднерусской породы и одним признаком южной породы - 28 образцов пчел, т.е. таким сочетанием признаков характеризовались более 50% особей, причем у большинства из них (24 образца) сочетались гантельный индекс и дискоидаль-ное смещение. Рис. 3. Кривые распределения значений кубитального индекса для всей выборки, для среднерусской породы и южных пород пчёл, установленных по локусу COI-COII мтДНК Рис. 4. Кривые распределения значений гантельного индекса для всей выборки, для среднерусской породы и южных пород пчёл, установленных по локусу COI-COII мтДНК Т а б л и ц а 2 Сочетание морфометрических показателей, характерных для южной и среднерусской пород, у пчел пасеки д. Леботёр Сочетание признаков у особей Кол-во пчел с данными признаками к общему числу, шт. (%) 3 признака одной породы х1 + х2 + х3 с с с х1 + х2 + х3 ю ю ю 7 (12,96) 4 (7,40) Всего 11 (20,36) 2 признака х1 + х2 + х3 с с ю 2 (3,70) среднерусской и х1 + х2 + х3 с ю с 2 (3,70) 1 признак юж х1 + х2 + х3 ю с с 24 (44,44) ной пород Всего 28 (51,86) 2 признака юж х1 + х2 + х3 с ю ю 0 ной и 1 признак х1 + х2 + х3 ю с ю 8 (14,81) среднерусской х1 + х2 + х3 ю ю с 7 (12, 96) пород Всего 15 (27,77) Примечание. х1, х2, х3 - показатели кубитального индекса, гантельного индекса и дис-коидального смещения соответственно; с - признак, характерный для среднерусской породы, ю - признак, характерный для южной породы. В ряде исследований морфометрических параметров медоносных пчел оценивается информативность различных показателей крыла, включая ку-битальный и гантельный индексы, дискоидальное смещение. Отмечается, что диагностическое значение отдельных морфометрических показателей крыла требует пересмотра. Однако указывается высокая информативность отдельных морфометрических показателей только при их комплексном использовании [5]. Молекулярно-генетический анализ. Пчелы, исследованные морфометри-чески, были также проанализированы молекулярно-генетическими методами (рис. 2). Было выявлено два аллеля локуса COI-COII мтДНК: аллель PQQ, соответствующий среднерусской породе, был обнаружен у 24 особей (44,44%); аллель Q, соответствующий южным породам пчел, выявлен в 30 образцах (55,56%). Поскольку передача митохондриального генома у пчел происходит только по «материнской» линии, полученные результаты отражают вклад в структуру генофонда пасеки д. Леботёр среднерусской и южных пород только по линии самок. Сочетание морфометрических и молекулярно-генетических показателей. Интересные результаты удалось получить при комплексной оценке показателей, как морфометрических, так и молекулярно-генетических. Разделение всей выборки пчел на группы по генетическому маркеру COI-COII мтДНК - среднерусская порода (аллель PQQ) и южные породы (аллель Q) -и построение соответствующих кривых распределения позволили детализировать полученные результаты (см. рис. 3 и 4). Кривая распределения значений кубитального индекса для группы особей, соответствующей по данному генетическому маркеру южным породам, показала пик с «горбом» в районе значений кубитального индекса 44-52%, что соответствует южным породам; второй пик в районе значений кубитального индекса, равных 54-58%, является показателем гибридных форм (см. рис. 3). Кривая распределения значений кубитального индекса для группы особей, соответствующей по генетическому маркеру среднерусской породе, имеет также несколько пиков: небольшой пик в районе значений кубитального индекса 42-46% соответствует карпатской породе; «высокий» пик в районе 50-52% указывает на южную желтую кавказскую породу; второй «высокий» пик, расположенный в зоне значений кубитального индекса выше 58%, указывает на среднерусскую породу (см. рис. 3). Таким образом, полученные результаты показывают на вклад отдельных пород медоносной пчелы в формирование гибридных форм и популяции в целом. По-видимому, карпатская порода медоносной пчелы, активно завозимая на пасеки области, вносит определенный вклад в формирование помесных форм. Среднерусская пчела также образует гибридные формы с желтой кавказской породой. Кривые распределения значений гантельного индекса пчел двух групп, выделенных по генетическому маркеру, характеризуются некоторой проти-вофазностью, кроме зоны значений 0,88-0,94 отн. ед., видимо, соответствующей гибридным пчелам. Согласно данным морфометрического и молекулярно-генетического анализа, морфометрическими признаками, наиболее согласованными со среднерусской породой, выявленной по локусу COI-COII мтДНК, являются гантельный индекс и дискоидальное смещение, тогда как кубитальный индекс оказался наименее информативным параметром (табл. 3). Т а б л и ц а 3 Количество пчел, соответствующее среднерусской и южной породам по отдельным морфометрическим показателям и маркеру COI-COII мтДНК (n = 54) Показатель Среднерусская порода (аллель PQQ) Южные породы (аллель Q) Локус COI-COII 24 (0,4444 ± 0,0676) 30 (0,5556 ± 0,0676) Кубитальный индекс 6 (11,11) 25 (46,29) Гантельный индекс 17 (31,48) 6 (11,11) Дискоидальное смещение 13 (24,07) 3 (5,56) Большинство особей (55,56%) относится к южной породе пчел по генетическому маркеру. Однако не обнаружено ни одной особи, имеющей полное соответствие южной породе как по генетическому маркеру, так и по морфометрическим показателям (табл. 4). Показан небольшой процент пчел (14,8%), имеющих аллель Q и два «южных» морфометрических признака. В подавляющем большинстве случаев (18 образцов) особи, имеющие аллель Q, обнаружили два морфометрических признака, характерные для среднерусской породы (33,3%). Полное соответствие пчел среднерусской породе, как по генетическому маркеру, так и по морфометрическим показателям, обнаружено только у трех особей (5,6%). У 10 особей (18,5%), имеющих аллель PQQ, выявлено два признака, характерных для среднерусской породы, и один - для южной (табл. 4). Т а б л и ц а 4 Соотношение морфометрических показателей у особей с различными генетическими вариантами по локусу COI-COII мтДНК мтДНК Аллель PQQ Аллель Q Сочетание признаков, характерных для разных пород Порода среднерусская | южная среднерусская южная Количество особей, шт. (%); всего 24 (44,44) Количество особей, шт. (%); всего 30 (55,56) 3 признака xl+x2+xi 3 (5,6) 4 (7,4) 4 (7,4) 0 (0,0) 2 признака, всего В том числе: х1+х2 х1+х3 х2+х3 10 (18,5) 1 (1,9) 2 (3,7) 7 (13,0) 7 (13,0) 1 (1,9) 6 (11,1) 0 18 (33,3) 1 (1,9) 0 17 (31,5) 8 (14,8) 6 (11,1) 2 (3,7) 0 1 признак, всего 7 (13,0) 10 (18,5) 8 (14,8) 18 (33,3) Примечание. х1, х2, х3 - показатели кубитального индекса, гантельного индекса и дискои-дального смещения соответственно. По мтДНК среднерусская и южные породы могут быть строго идентифицированы. Однако на пасеке д. Леботёр у особей пчел практически не регистрируется соответствие данных по мтДНК и морфометрических показателей, характерных для соответствующих пород. Это указывает на процесс метисации среднерусской и южных пород в популяции медоносной пчелы на данной пасеке. Процесс «вытеснения генов» у пчел среднерусской породы менее масштабный, поскольку среди особей, обладающих характерным для данной породы локусом COI-COII, зарегистрирован меньший процент пчел с мор-фометрическими признаками, характерными для южных пород, по сравнению с аналогичными данными, показанными для пчел с локусом Q. Возможной причиной данной ситуации являются особенности формирования популяции пчел: южные породы стали завозиться на пасеки недавно и доля новых пчелосемей южных пород от общего числа пчелосемей пасеки была незначительной. Заключение Для характеристики популяции пчел пасеки д. Леботёр были использованы как морфометрические, так и генетический маркеры. Каждый отдельно взятый показатель не дает возможности полно оценить состояние популяции. Митохондриальный маркер позволяет однозначно определить происхождение особи, но только по линии самки. Кубитальный индекс - достаточно информативный показатель чистопородности медоносной пчелы. Для анализа породного состава в гибридных популяциях кубитальный индекс наиболее значим в сочетании с генетическим маркером, поскольку позволил детализировать вклад отдельных пород в формирование популяции в д. Леботёр. Гантельный индекс является необходимым, но недостаточным показателем для оценки популяций медоносной пчелы. Возможно, в сочетании с дискоидаль-ным смещением он позволит охарактеризовать популяцию более детально. Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что только комплексный анализ (различные морфометрические показатели в сочетании с генетическими маркерами) обеспечивает более полное описание популя-ционно-генетической структуры медоносной пчелы. Полученные результаты современного состояния популяции медоносной пчелы на пасеке в д. Леботёр позволяют рассматривать процесс метисации пчел пасеки как необратимый. Восстановление данной популяции пчел, обладающей генофондом среднерусской породы, возможно в случае максимальной замены гибридных пчел на чистопородных с дальнейшим постоянным контролем состояния генофонда и индивидуальным отбором пчелосемей на пасеке. Особая благодарность д-ру биол. наук, руководителю научно-исследовательской лаборатории биотехнологии и биоинженерии О.В. Карначук за помощь в проведении экспериментальной части работ.

Скачать электронную версию публикации